Izolarea si identificarea serotipului Ecoli O157:H7 in unele produse alimentare de origine animala - LUCRARE DE DIPLOMA

U.S.A.M.V

Facultatea de Medicinǎ Veterinarǎ Bucuresti

Colegiul de Igienǎ si Laborator Veterinar

LUCRARE DE DIPLOMA

Izolarea si identificarea serotipului

Escherichia coli O₁₅₇:H₇

in unele produse alimentare de origine animala

Scopul lucrǎrii 

Interesul fatǎ de Escherichia coli O₁₅₇:H₇ a crescut enorm incepand cu anul 1993 in toata lumea, lucru dovedit prin aparitia unui numǎr mare de lucrǎri cu acest subiect.

Scopul acestei lucrǎri este de a pune in evidentǎ cazurile de izolare si identificare ale acestei bacterii in produsele alimentare de origine animalǎ. Escherichia coli O₁₅₇:H₇ are o deosebitǎ importantǎ atat in medicina umanǎ cat si veterinarǎ, fiind un agent de temut al toxiinfectiilor alimentare.

Se stie ca in SUA reprezinta o problemǎ nationalǎ, economicǎ si sanitarǎ, de aceea cu cat problema este mai mult evidentiatǎ, gasindu-se solutii pentru eradicarea ei cu atat riscul de a crea probleme majore se diminueazǎ semnificativ.

Trebuie cunoscut modul in care aceastǎ bacterie contamineazǎ alimentele, care este sursa sa de provenientǎ, ce factori contribuie la multiplicarea si supravietuirea ei, ce factori o inactiveaza si ce mǎsuri trebuie luate pentru a preveni transmiterea ei.

Trebuie stiute riscurile pentru sǎnatatea publica, evolutia clinicǎ a unui pacient dupa ingestia unui aliment contaminat cu E.coli O₁₅₇ :H₇, forme de manifestare ale infectiei, modul in care actioneazǎ bacteria datoritǎ factorilor de patogenitate si terapia in caz de contaminare, de aici si necesitatea antiserurilor specifice.

Lucrarea ilustreazǎ metode de detectare a bacteriei si sunt enumerate anumite episoade de toxiinfectii cu EHEC la noi cat si in alte tari, in special in SUA, locul ei de « bastinǎ » ca sǎ spunem asa.

Avand in vedere faptul cǎ o toxiinfectie cu aceastǎ bacterie poate evolua letal se recomandǎ ca toate tǎrile sǎ implementeze programe de supraveghere fata de E.coli O₁₅₇ :H₇, mai ales pentru tǎrile care efectueazǎ schimburi comerciale cu carnea de vitǎ.

S-au semnalat cazuri de infectie in laboratoare, de aceea personalul de laborator trebuie sǎ-si ia masuri de protectie adecvate atunci cand lucreazǎ cu aceastǎ bacterie.

La sfarsitul acestei lucrǎri trebuie sǎ se gǎseascǎ un raspuns la urmatoarele intrebǎri : de ce interes pentru aceastǎ bacterie ? ce se stie referitor la E.coli O₁₅₇ :H₇ ? ce mǎsuri trebuie luate pe viitor in legaturǎ cu aceastǎ problemǎ ?

Introducere

Dupǎ anul 1950, numeroase tulpini de Escherichia coli au fost incriminate de multe ori ca fiind agenti etiologici ai diareei infantile. Aproximativ 0,1% din totalul bacteriilor care se gǎsesc in intestinul unui adult sunt reprezentate de E.coli. In intestinul unui nou nǎscut aceastǎ bacterie, reprezintǎ cea mai abundentǎ florǎ intestinalǎ impreunǎ cu lactobacilii si enterococii [1].

In ultimul timp literatura de specialitate a semnalat multe cazuri si episoade de toxiinfectie alimentarǎ la om provocate de serotipul de Escherichia Coli O₁₅₇:H₇.

Dupǎ cum se stie bacteria E.coli este larg rǎspanditǎ in naturǎ, ea gǎsindu-se in mod normal in intestinul omului si animalelor cu sange cald si uneori si in apa de bǎut contaminatǎ cu fecale. Deseori aceastǎ bacterie contamineazǎ produsele alimentare de origine animalǎ ca urmare a conditiilor de igienǎ necorespunzǎtoare in care se realizeaza si manipuleaza.

Unele serotipuri de E.coli sunt patogene si implicate de multe ori in imbolnaviri cu caracter digestiv la om si animale. La om asemenea tulburǎri apar mai frecvent la copii si bǎtrani sau la persoanele cu rezistentǎ organicǎ diminuatǎ si sunt consecinta consumǎrii unor alimente contaminate si insuficient tratate termic: carnea de bovine insuficient fiartǎ, laptele crud, branzeturile din lapte de vacǎ crud, apa netratata [2].

Cu toate acestea, marea majoritate a tulpinelor E.coli sunt benefice si chiar esentiale pentru organism. Intervin in descompunerea celulozei, in absorbtia vitaminei K si sintetizarea complexului B de vitamine [3].

Fetusul oricǎrui animal este complet steril. Imediat dupǎ nastere, noul -nǎscut preia tot felul de bacterii care trǎiesc in simbiozǎ ( noi le ajutǎm pe ele sǎ trǎiascǎ si ele ne ajutǎ pe noi sǎ traim) cu nou- nǎscutii cat si de-a lungul intregii vieti. Din ziua in care ne-am nǎscut cǎpǎtǎm aceste bacterii. Bacterii care ne ajutǎ, sunt localizate in pǎrti ale organismului care au contact cu aerul, intestinul nostru, de-a lungul tractului respirator si niciodatǎ in sange sau in tesuturile organismului. Este adevǎrat cǎ mii de astfel de mici creaturi fac lucruri de care noi avem nevoie, cum ar fi ajutorul in digerarea hranei. Animalele care se nasc « germ free », au peretele intestinal subtire, batǎile inimii firave, si primesc numeroase vitamine ca sǎ rǎmanǎ in viatǎ [1].

Istoric 

Bacteria E.coli a fost descoperitǎ in colonul uman in 1885 de bacteriologul german Theodor Escherich (1857-1911) la universitatea din Wüerzburg.

El a observat cǎ in materiile fecale ale copiilor nou-nǎscuti apar, dupǎ alǎptare, bacterii si in primul rand o bacterie Gram negativǎ, nesporulatǎ, cǎreia autorul ii dǎ numele de Bacterium coli commune si pe care o diferentiazǎ de o altǎ bacterie intestinalǎ, numita Bacterium lactis aerogenes [4].

Fig.1: Theodor Esherich descoperitorul E.coli

Pe data de 9-12 octombrie 2007 se vor sarbǎtori 150 de ani de la nasterea Dr.Escheriche motiv pentru care Universitatea din Wüerzburg va desfǎsura simpozioane, conferinte de biologie molecularǎ si de patogenitate a E.coli [5].

Escherichia coli O₁₅₇:H₇ a fost izolatǎ si identificatǎ pentru prima datǎ in SUA in 1975 de la o femeie de 50 de ani din California [6] care prezenta crampe intestinale si diaree hemoragicǎ gravǎ. In perioada 1978-1982, cercetǎtorii laboratorului central pentru combaterea bolilor din Canada, studiind tulpinile de E.coli enterotoxigene si citotoxice provenite de la bolnavi cu diaree au izolat sase tulpini citotoxice de E.coli O₁₅₇:H₇. Aceste date care se referǎ la cazuri sporadice de gastroenteritǎ, au sugerat ca E.coli O₁₅₇:H₇ poate fi un germen patogen pentru om, dar ele nu au fost suficiente pentru a trage concluzia definitiva cǎ aceastǎ bacterie era cauza bolii enterice. Abia in 1982, odata cu descrierea pentru prima datǎ a doua episoade de infectie alimentarǎ cu cazuri de imbolnaviri foarte grave, epidemiologii si microbiologii au facut legatura intre E.coli O₁₅₇:H₇ si colita hemoragicǎ a pacientilor de la care au izolat-o. Din cauza asocierii cu enterocolita hemoragicǎ , aceastǎ bacterie a fost denumita Escherichia coli enterohemoragica, iar serogrupa din care face parte, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Acest patotip, descoperit relativ recent, prezinta o importanta deosebita pentru medicina umanǎ si veterinarǎ. In patologia umanǎ E.coli O₁₅₇:H₇ a devenit in scurt timp unul din cei mai de temut agenti ai toxiinfectiilor alimentare umane. Episoadele de toxiinfectie alimentarǎ descrise, in special in SUA, cu incepere in 1982, au aparut ulterior in mai multe tari dezvoltate, gravitatea si extinderea lor capǎtand uneori dimensiuni neobisnuite. Din acest punct de vedere, ele intrec de multe ori pe cele provocate de salmonele. In prezent sunt cunoscute episoade cu 700 sau 9000 de cazuri si numai datoritǎ faptului ca ele au aparut in tǎri foarte dezvoltate (SUA, Japonia), in care existǎ o ingrijire medicalǎ corespunzatoare, nu s-au soldat cu mai multe cazuri mortale. Pentru a ne face o idee mai exactǎ asupra gravitatii si implicatiilor sanitare si economice ale imbolnǎvirilor produse de E.coli O₁₅₇:H₇ mentionǎm ca in SUA ele reprezintǎ o problemǎ nationalǎ, numarul de cazuri pe an fiind de 10.000-20.000. Costurile evaluate pentru tratamentul medical si scaderea productivitatii din cauza acestor imbolnaviri se situeaza intre 216-580 milioane de dolari pe an, iar dacǎ se pun la socotealǎ si cheltuielile care se fac pentru supravegherea si prevenirea lor, ele ajung la cateva bilioane de dolari. Dacǎ se are in vedere durerea si suferinta deosebit de intense in formele severe, sau cazurile mortale, ne putem face o imagine mai completǎ asupra importantei acestor imbolnaviri pentru sǎnǎtatea publica si asupra impactului lor economic. Aici trebuie avut in vedere si faptul cǎ, in prezent, se diagnosticǎ un numar redus de cazuri, in cele mai multe tǎri, in raport cu cel real si faptul cǎ raportarea lor nu se face decat intr-o micǎ mǎsurǎ.

Descrise pentru prima data in SUA, imbolnavirile produse de E.coli O₁₅₇:H₇ au inceput sǎ fie raportate ulterior si in alte tǎri dezvoltate ca Anglia, Canada, Franta, Germania, Japonia. Ele au avut aspectul unor epidemii de toxiinfectie alimentarǎ extinse si de mare interes national, motiv pentru care au fost incluse printre afectiunile majore [2].

Partea I

Studiu bibliografic 

1.Caractere generale ale E.coli

Fig.2 : Structura E.coli O₁₅₇ :H₇

Escherichia coli face parte din :

-increngǎtura Proteobacteria

-clasa GammaProteobacteria

-familia Enterobacteriaceae

1.1 Caractere morfologice 

E.coli se prezintǎ obisnuit sub formǎ de bacili sau cocobacili, de dimensiuni de 1-4μ/ 0,4-0,6μ. Frecvent sub influenta a diferiti factori de mediu, genereazǎ forme filamentoase de o lungime pana la 8-10μ sau, din potrivǎ, forme cocoide. Formele « L », care apar in vivo sau in vitro, sub actiunea inductoare a antibioticelor sau a altor factori, prezintǎ elemente sferice de mǎrimi foarte variate, mergand de la corpusculi elementari situati la limita puterii de rezolutie a microscopului optic, panǎ la corpi globulosi, foarte mari (5-20μ).

Sunt Gram negativi, nesporulati si in general mobili, prezentand cili dispusi peritrich. Majoritatea tulpinilor ce se izoleazǎ din intestinul animalelor sǎnatoase nu prezinta capsulǎ. Din infectiile de la animale si om se pot izola atat tipuri capsulare, cat si necapsulare.

Cercetarile de microscopie electronicǎ au demonstrat ca unele celule de E.coli, ca si alte bacterii Gram negative, mobile sau imobile, pot prezenta la suprafata celulei bacteriene formatiuni filamentoase, tubulare, rectilinii, rigide numite fimbrii sau pili [4].

1.2 Caractere culturale 

Facultativi anaerobi, se dezvoltǎ pe medii uzuale optim la 37sC (14-44sC), in 24 de ore. Dezvoltǎ colonii caracteristice lactozo-pozitive. In bulion cultura prezintǎ turbiditate medie sau intensǎ, inel (in culturi vechi), depozit necaracteristic cu miros amoniacal. Pe agar se dezvoltǎ colonii mijlocii , de tip « S », nepigmentate, semitransparente. Pe agar sange se obtin colonii α, β hemolitice. Dimensiunile coloniilor sunt foarte variabile, diametrul fiind cuprins intre 2 si 10 mm. Sub actiunea bacteriofagilor se obtin uneori pe gelozǎ colonii « M », uleioase-lizogene sau vitroase-nelizogene, iar sub actiunea antibioticelor pot rezulta mutante, care formeaza colonii « G », pitice [7,4].

Principalele 1.3 caractere biochimice : indol pozitiv, reactioneazǎ negativ la testul Voges-Proskauer si pozitiv la testul cu rosu metil, nu produce hidrogen sulfurat, nu descompune ureea, nu lichefiazǎ gelatina, fermenteazǎ glucoza si lactoza, cu productie de gaz, reduce nitratii in nitriti [8].

E.coli face parte din microflora tractului intestinal a majoritatii animalelor cu sange cald deci si a omului. Marea majoritate a tulpinilor fac parte din flora intestinalǎ comensalǎ banalǎ a intestinului, dar existǎ de asemenea, cateva tulpini de E.coli responsabile de gastro-enteritǎ chiar si la om.

1.4 Structura antigenicǎ 

Exista trei principale tipuri de antigene de suprafatǎ :

. Antigenele somatice O, de naturǎ glucido-lipo-polipeptidicǎ, fiind aproape identice cu endotoxina, deosebirea constand in faptul cǎ partea lipidica-foarte toxica este neantigenicǎ, pe cand componenta polizaharidicǎ la ambele este purtatoarea specificitatii antigenice. Antigenele O sunt termostabile, rezistǎ la 100sC timp de 2ore si jumatate. Exista 171 de serotipuri diferite.

.Antigenele flagelare H, corespunzand flagelinei, peptid care constitue flagelii bacteriilor. Sunt termolabile si rezistente la actiunea formolului. Fatǎ de acidul clorhidric si alcooli prezintǎ o sensibilitate mare. Toate antigenele H de E.coli sunt monofazice si majoritatea lor sunt specifice. Exista 56 de sorotipuri diferite.

.Antigenele capsulare K, de natura polizaharidicǎ nu sunt prezente decat daca bacteria posedǎ capsulǎ. In functie de coportamentul fatǎ de diferite substante chimice si temperaturǎ s-au deosebit trei tipuri de antigene :L, B si A. Exista 74 de antigene diferite [4, 9].

1.5 Patogenitatea 

Tulpinile comensale ale E.coli nu sunt patogene, dar pot fi implicate in unele infectii oportuniste. Totusi exista tulpini ale E.coli patogene, care posedǎ factori de virulentǎ specifici, separate in patru grupe dupǎ tipul infectiei:

. E.coli enteropatogena ( sau EPEC , <EnteroPathogenic E.coli>) sunt in mare parte responsabile de diareea infantilǎ, in tǎrile in curs de dezvoltare.

.E.coli enterotoxigene ( sau ETEC , <EnteroToxinogenic E.coli>) sunt respon- sabile de diareea turistilor, si de asemenea sunt principala cauzǎ a diareei infantile in tǎrile in curs de dezvoltare.

.E. coli enteroaderente ( sau EAEC, sau EIAC, <Enteroinvasive E.coli>)

.E.coli enterohemoragice ( sau EHEC, <EnteroHaemorragic E.coli>) fǎcand referire la E.coli producatoare de toxina -Shiga patogenǎ pentru om ( sau STEC , Shiga-Toxin produsa de E.coli din care face parte Escherichia Coli O₁₅₇ :H₇) [9].

1.6 Rǎspandirea E.coli in naturǎ. Surse de infectie pentru animale si om 

.Raspandirea E.coli patogene prin apǎ 

Apa poate constitui o cale de difuziune pentru cele mai variate boli si in mod deosebit pentru cele produse de catre bacteriile, virusurile si parazitii ce sunt excretati prin dejectiile omului si animalelor. Existǎ o stransǎ corelatie intre gradul de poluare al apei, adancimea stratului captat, amplasarea fatǎ de sursele de poluare ( platforma de bǎlegar, apa rezidualǎ) precum si unele deficiente de constructie.

Un studiu mai amanuntit al microbiologului Petrov , cu 24 de seruri specifice pentru infectiile omului si animalelor, a relevat o frecventǎ de 17,5% in cazul apei de fantanǎ, 2,3% in cazul apei de izvor si 1,5% in cazul centralelor.

.Transmiterea tipurilor patogene de E.coli prin aer

Posibilitatea transmiterii infectiilor cu E.coli pe calea aerului este de asemenea admisǎ si prezintǎ o importantǎ deosebitǎ, atat in cazul omului cat si animalelor.

La vitei se cunoaste ca infectia cu unele serotipuri mai virulente se produce mai ales prin cavitatea naso-faringianǎ.

.Rolul laptelui si al produselor lactate in transmiterea tulpinilor patogene de E.coli

Mai multe cercetǎri atrag atentia asupra faptului cǎ laptele poate contine diferite tulpini patogene pentru om si animale.

Printre factorii care influenteaza gradul de contaminare a laptelui, igiena mulsului joaca un rol de prim ordin. Numerosi autori arata ca starea igienica a adapostului, a vacilor si a oilor in lactatie, toaleta mulgatorului si a glandei mamare, gradul de curatenie a instalatiei de muls, sunt tot atatea elemente care influenteaza gradul de contaminare a laptelui cu microbi. Trebuie avut in vedere faptul cǎ ingrijitorii sunt deseori purtatori. Se pare, deci, cǎ in fermele pentru productia de lapte se pot crea conditii favorabile circulatiei complexe a tipurilor potential patogene de E.coli de tipul animal-om-animal, ceea ce amenintǎ sanatatea consumatorilor.

.Rolul carnii si al produselor derivate ca surse de infectie pentru om cu tipuri patogene de E.coli.

Izolarea acelorasi tipuri serologice de E.coli din infectii de la animale si om situeaza colibaciloza in randul zoonozelor. Carcasele animalelor sacrificate in abator constitue calea principala prin care tulpinile de E.coli sunt introduse pe fluxul tehnologic, preparatele crude din carne pot constitui o cale importanta de raspandire. Operatiunile de preparare a unor produse (dezosare, fragmentarea, prepararea amestecurilor, etc) pot favoriza diseminarea bacteriilor in profun- zimea acestora. Nerespectarea retetelor de preparare si a temperaturii, la fel, contribuie la ineficienta unor prelucrari termice, creindu-se astfel conditii pentru persistenta sau chiar inmultirea germenilor.

Toate acestea obliga personalul veterinar la o mai buna si permanenta supraveghere asupra respectarii regulilor igienico- sanitare in timpul sacrificarii, transarii, ambalarii si expedierii carnii si a produselor de carne.

.Raspindirea tipurilor patogene de E.coli prin ouale contaminate.

Transmiterea tipurilor patogene de E.coli prin oua se realizeaza in mod diferit, dependent de specificul fiecarei unitati. In unele cazuri, E.coli poate fi incorporata in ou datorita unei infectii a oviductului, oul contaminandu-se in momentul in care traverseaza oviductul sau, in cazul ovaritelor, oul poate contine germenul din momentul ovulatiei.

Contaminarea oualor in ferma se mai poate face prin : contaminare cu fecale, care pot contine serotipuri patogene pentru animale si om, contactul cu alte oua murdare, spalarea cu apa contaminata, depunerea prafului din adapost care contine bacterii, contactul cu mainile sau cu imbracamintea murdara a ingrijitorilor.

Fiind destul de rezistenti la actiunea lizozimului, uneori, colibacilii reusesc sa se multiplice in ou [4].

2. Serotipul E.coli O₁₅₇ :H₇ 

Fig.3: E.coli O₁₅₇:H₇

E.coli O₁₅₇:H₇ prezinta caracterele culturale, morfologice, tinctoriale si biochimice tipice pentru specia E.coli, cu exceptia incapacitǎtii de a fermenta sorbitolul si de a produce -D-galactoxidazǎ si -D-glucuronidazǎ. Cercetǎri recente au scos in evidentǎ cǎ aceste criterii si procedee de identificare prezintǎ unele dezavantaje, principalul fiind specificitatea lor limitatǎ, deoarece si alte tipuri de E.coli decat cele enterohemoragice (O₁₅₇:H₇) posedǎ cel putin una din aceste propietǎti. De asemenea, unele specii de salmonele (grupa N), unele tulpini de Yersinia enterocolitica si chiar Brucella spp. poseda fractiuni de antigene somatice (1-2-linked 4-amino-4, 6-dideoxy - -D-mannopyranoza) comune cu E.coli O₁₅₇:H₇. De aceea antiserul E.coli O₁₅₇ reactioneazǎ incrucisat cu aceste bacterii, ceea ce a determinat pe unii cercetǎtori sǎ identifice alti markeri pentru a mǎri specificitatea procedeelor de detectie a tulpinelor de E.coli antero- hemoragice. Plecand de la identificarea a doua proteine de membrana care exista numai la serotipurile O₁₅₇:H₇ si la O₂₆:H₁₁, Padhye si Doyle au preparat un anticorp monoclonal (4E₈ C₁₂) care este specific pentru aceste proteine , cu care au pus la punct un imunotest rapid, sensibil si specific prin tehnica ELISA pentru detectarea si izolarea serotipului O₁₅₇:H₇ in alimente.

Serotipul de E.coli O₁₅₇:H₇ se intalneste mai rar in naturǎ, dar patogenitatea sa pentru om se pare cǎ este mult mai mare decat a altor serotipuri patogene, ceea ce a atras atentia specialistilor, in mod deosebit si a stimulat intreprinderea mai multor investigatii.

Se dezvolta bine pe medii obisnuite la temperaturi cuprinse intre 30sC si 42sC si slab sau nu se dezvolta la temperature de 44sC-45sC. Din aceasta cauzǎ, in ultimii ani s-a renuntat la incubarea la 44sC -45sC pentru aceasta bacterie, acceptandu-se temperatura maxima de 42 sC. Spre deosebire de alte serotipuri si serogrupe, E.coli O₁₅₇:H₇ se dezvolta mai discret pe suprafata agarului nutritiv, formand colonii mai mici si, de regulǎ, aderente de agar. De asemenea, pe agarul Mac Conkey cu sorbitol formeaza colonii sorbitol negative, transparente si mult mai mici decat coloniile tulpinilor sorbitol pozitive care sunt mult mai mari si colorate in rosu -rubiniu [2, 10].

O serie de factori influenteaza multiplicarea si supravietuirea E.coli O₁₅₇:H₇ in alimente, asupra carora Vernozy-Rozand si Ray-Gueniot au insistat in lucrarea lor [11].

Temperatura optimǎ de dezvoltare este cea de 37sC la care timpul de generatie este 0,49 ore. Desi se multiplicǎ la 42sC, timpul de generatie este mai mare, ceea ce arata ca temperaturile mai mari de 42sC sunt disgenetice.

Congelarea Bacteria supravietuieste la temperature mai mici de -80sC in carnurile de vitǎ tocatǎ. Distrugerea celulara este foarte limitata in timpul depozitarii timp de 9 luni la -20sC. Dupa un an de depozitare la aceasta temperatura E.coli O₁₅₇:H₇ este omoratǎ in 70% din probele de carne tocatǎ.

Refrigerarea Se poate multiplica cu o rata redusa la temperatura minime de -65sC-72sC daca celelalte conditii sunt favorabile. S-a constatat cǎ se multiplicǎ in sucul de mere nefermentat pǎstrat la 8sC si in salata la 12sC. O refrigerare buna (< 5sC) opreste multiplicarea bacteriei ,dar nu si supravietuirea care poate dura mai multe saptamani.

Temperatura ridicatǎ Inactivarea E.coli O₁₅₇:H₇ in carnea tocata de vita, porc sau pui are loc la temperaturi mai mari de 64sC. Pasteurizarea laptelui in aparate cu placi omoara bacteria in 16,2 secunde, chiar daca se afla intr-un numar mare. Ea ar putea sa se multiplice in anumite faze de fabricatie a branzei "Cottage", dar este distrusa in timpul oparirii coagulului (57sC-90 minute). Ca si alte bacterii, termorezistenta ei se poate modifica sub actiunea diferitilor factori. Ea creste in absenta oxigenului in faza stationara de multiplicare a bacteriei si in functie de natura alimentului in care se gaseste. Rezista mai mult la caldura cand e inglobata in produsele grase, iar in solutiile zaharate, mai mult decat cele in solutie de clorura de sodiu. Un soc termic de 5 minute la 42sC mareste rezistenta ulterioara la 55sC de 1,5-2,8 ori. Dupa unii cercetatori termorezistenta E.coli O₁₅₇:H₇ este asemanatoare cu aceea a salmonelelor.

Bacteria rezista si se multiplica bine in medii cu 2,5% si 6,5% clorura de sodium [

Nu existǎ o evidenta geografica definitiva a cazurilor de infectie cu Esherichia coli O₁₅₇:H_7. Doi ani de studiu au concluzionat ca un procentaj important de tulpini pozitive de E.coli O₁₅₇:H₇ au aparut in spitalele din nordul si vestul U.S fata de sudul tarii. Aceste cazuri sporadice de O₁₅₇:H₇ si focare prefera un anumit sezon. Patru studii in U.S au relevat ca cel putin 67% din cazurile sporadice au aparut intre mai si septembrie, culminand in iulie si august. Din toate focarele aparute in U.S asociate cu O₁₅₇, 88% au aparut intre mai si noiembrie. Un alt studiu din statul Washington a gasit rata cea mai mare de izolare a E.coli O₁₅₇:H₇ in lunele de vara, dar punctul cel mai inalt de aparitie a fost luna septembrie cu 13 de cazuri pozitive la 1000 de probe [6].

Toleranta la aciditate Observatiile epidemiologice demonstreaza ca aceasta bacterie rezista in unele produse acide cum sunt iaurtul si sucul de mere nefermentat pastrat la 8sC, alimente care au stat la originea unor toxiinfectii alimentare. Este stabilit ca pH-ul minim la care se poate multiplica este 4,5, daca toate celelalte conditii de crestere sunt favorabile. Incubarea la temperaturi mai mari de 8sC reduce rezistenta la aciditate. De mentionat ca in SUA s-a descris un episod de toxiinfectie alimentara prin consumul unei maioneze cu pH 3,8. Rezistenta la aciditate depinde si de tipul acidului prezent in produs. Astfel, acidul acetic este mai activ decat acidul lactic si ambii mai activi decat acidul clorhidric, la aceeasi valoare de pH. De aici se deduce ca unele produse acide obtinute prin fermentare bacteriana (iaurtul, saramurile crude, s.a) nu pot garanta absenta E.coli O₁₅₇:H₇ si se impun precautii de rigoare. Contrar celor afirmate de unii autori in privinta E.coli generice, serotipul O₁₅₇:H₇ tolereaza mai bine aciditatea decat salmonelele. Razele ionizante in doze mici (1,5-2,5 Kcy) omoara bacteria din carnea tocata.

Unii conservanti alimentari ca sorbatul si benzoatul limiteaza multiplicarea acestei bacterii si maresc gradul de inactivitate termica a ei. Aceasta activitate este in functie si de alti factori ca pH-ul , continutul in clorura de sodiu si temperature de depozitare a produsului [2].

3. Contaminarea cu E.coli O₁₅₇ :H₇ 

Sursa principala a infectiei este carnea de vita nepreparata corespunzator.

Alte surse includ consumarea laptelui si sucurilor nepasteurizate, in special cele de mere, alimente de origine vegetala ( varza cruda, ridichi de luna, patrun- jelul) cultivate pe terenuri fertilizate cu ingrasamant natural provenit de la bovine, in special, sau irigate cu apa din surse contaminate prin fecalele animalelor purtatoare.

Contactul cu animale purtatoare poate fi o alta sursa de contaminare. Transmiterea prin apa are loc cand se innoata in lacuri contaminate, piscine sau cand se consuma apa neclorinata corespunzator.

Transmiterea se face de la persoana la persoana si este greu de controlat mai ales in centrele de ingrijire a copiilor sau in azilele de batrani.

E.coli O₁₅₇:H₇ se gaseste la un numar mic de vite de ferma si poate sa traiasca in intestinul vitelor sanatoase. Specii ca vitele, porcii, puii, oile si caprioarele care nu au receptori specifici pentru toxina acestei bacterii o pot adaposti fara a arata semne de boala, raspandind-o prin fecale de unde poate fi transmisa oamenilor.

Carnea poate fi contaminata in timpul taierii vitelor, cand se produce contactul intestinelor animalelor si a fecalelor cu carcasa. Carnea contaminata arata si miroase normal si poate fi o sursa de infectie daca este prajita sau fiarta la temperaturi mici. Bacteria prezenta in ugerul vitelor poate contamina laptele crud.

Modul de transmitere a E.coli O₁₅₇:H₇ la targurile de vite, la gradina zoologica si in vizitele facute la ferma este cu siguranta fecal-oral, prin ingestia bacteriei din hrana si apa contaminata sau prin transferul de pe mana la gura dupa contactul cu suprafete contaminate sau cu animalele [12].

4. Mecanismul patogenitatii serotipului O₁₅₇ :H₇  

Fig.4: E.coli O₁₅₇:H₇

Propietatile patogene ale unor tulpini de Escherichia coli au fost semnalate pentru prima data chiar de catre descoperitorul acestui germen, Theodor Escherich. Inoculand la iepuri si cobai culturi, autorul reuseste sa induca la acestia infectii letale. El constatǎ la nivelul intestinului hemoragii limitate, insotite de modificari la nivelul placilor Peyer si al foliculilor limfoizi din vecinatatea cecumului [4].

Colita hemoragicǎ produsǎ de o tulpina de E.coli O₁₅₇:H₇ si descrisa prima data intr-o epidemie aparuta in 1982 in Nord-Estul SUA, se deosebea de dizenteria bacilara clasica prin prezenta diareei abundente si hemoragice si lipsa febrei. In 1985 s-a raportat ca aceasta bacterie a produs unul din sindroamele urologice cele mai frecvente si mai grave cunoscute in pediatrie, numit sindromul hemolitic si uremic (SHU). Considerat pana atunci ca idiopatic, SHU este recunoscut astazi ca o complicatie a enterocolitei hemoragice produse de serotipuri de EHEC la copii sub cinci ani si la persoanele in varstǎ [2].

Aceast serotip are semnificatia cea mai mare pentru igiena alimentara, infectiile produse de el fiind legate de ingerarea alimentelor. El se izoleaza din fecalele bovinelor sanatoase, prin care se contamineaza carnea acestor animale in timpul procesului de taiere, ajungand pe aceasta cale sa fie ingerate de om. Bacteria de pe suprafata carcaselor poate ajunge in interiorul carnurilor in timpul operatiunilor de transare si tocare. In general carnea tocata de bovine trebuie considerata contaminata cu aceasta bacterie, motiv pentru care trebuie consumata numai dupa aplicarea unui tratament termic adecvat. Aceasta bacterie este inactivata in 8,34 minute la 60sC si in 0,13 minute la 68,3sC.

Bovinele reprezinta rezervorul principal pentru E.coli O₁₅₇ :H₇, dar s-a demonstrat ca si alte specii de animale pot fi purtatoare ale acestei bacterii, cum sunt porcii, micile rumegatoare, pisicile. E.coli O₁₅₇:H₇ este serotipul dominant al grupei EHEC in SUA, pe cand in Europa predomina alte serotipuri si mai rar se izoleaza E.coli O₁₅₇:H_7.

Tulpinile EHEC-like sunt frecvente in afectiunile diareice la vitel [2].

La porc se intalnesc mai frecvent serotipul O₁₃₈:K_81, O₁₃₉:K_85, cauza enterotoxiemiei de dupa intarcare, numita "boala edemelor". Aceste tulpini produc o varianta a toxinei SLT-II care injectata la purcei reproduce, aproape in totalitate, simptomele si leziunile bolii edemelor: edemul ploapelor, al mucoasei gastrice, edem si hemoragii ale colonului si cerebelului, leziuni histopatologice caracteristice de necroza vasculara. Administrarea orala la porc a tulpinilor EHEC-like ca si a serotipului E.coli O_157:H₇ de origine umana reproduce de asemenea boala edemelor. De aceea aceasta boala poate fi considerata ca un model experimental pentru SHU si indica rolul patogenic important al toxinelor VT-SLT in acest tip de afectiuni [2].

In ultimii ani au fost implicate in aceste sindroame si alte serogrupe sau serotipuri (O_26, O₁₁₁), dar peste 90% din tulpinile engleze si nord-americane apartin serotipului O₁₅₇:H₇. In tarile tropicale E.coli O₁₅₇:H₇ se izoleaza foarte rar.

S-au folosit numeroase modele experimentale pentru studierea rolului E.coli O₁₅₇:H₇ si a toxinelor sale in producerea modificarilor patologice: iepuri sugari, purcei gnotobiotici, pui de gaina de o zi , soareci adulti [10].

Iepurii sugari carora li s-a administrat aproximativ 10⁸ celule bacteriene, au manifestat diaree apoasa dupa 3-7 zile. Bacteria colonizeaza intestinul subtire si colonul si produce acumulare de lichid si destinderea cecumului si a colonului principal. Ea s-a identificat in numar mai mare in colon, iar modificarile histologice (moartea celulelor, mitoza in cripte, depletia mucinei, infiltratia cu neutrofile, in lamina propia si in epiteliu) s-au observat in principal in colonul mijlociu si distal. Nu s-au gasit bacterii in interiorul celulelor epiteliale sau in lamina propia [10].

Purceii gnotobiotici care au primit pe cale orala 10¹⁰-10¹¹ celule de E.coli O₁₅₇:H₇ s-au imbolnavit si au prezentat anorexie, letargie si diaree apoasa. Bacteria colonizeaza difuz suprafata cecumului, colonului si epiteliului criptelor. In locurile de atasare a bacteriei sunt distruse microvilozitatile, iar celulele epiteliale capata forme neregulata si se detaseaza.

Puii de gaina de o zi care au primit oral 10⁹ celule bacteriene li se colonizeaza in principal suprafata epiteliului cecal. Atasarea bacteriilor de epiteliul cecal se observa si dupa mai multe luni de la inoculare , ceea ce arata ca puii de gaina infectati raman purtatori si eliminatori de E.coli O₁₅₇:H₇ de lunga durata, iar cand ajung la maturitate produc oua contaminate [10].

Soarecii adulti inoculati intraperitoneal cu VT-1 produsa de E.coli O₁₅₇:H₇ manifesta paralizia membrelor posterioare si mor. Inocularea i.p. sau i.v. a filtratelor de cultura determina tulburari respiratorii, inapetenta, paralizia extremitatilor si moartea dupa 48h. Modificarile histologice constau in tulburari vasculare ale colonului, acumularea de sange in lumenul acestuia si subtierea peretelui. Leziunile merg de la moartea celulelor epiteliale pana la pierderea completa a mucoasei si a tesutului submucos pe 15-50% din mucoasa colonului. La nivelul rinichilor apar exfolieri ale celulelor epiteliale in tubii contorti si colectori si vacuolizari intracelulare [10].

4.1 Studii clinice ale infectiei cu E.coli O₁₅₇ :H₇ 

Simptomele infectiei cu E.coli O₁₅₇ :H₇ apar dupa 2-10 zile de la ingestie. Majoritatea persoanelor se recupereaza dupa 7-10 zile. Severitatea simptomelor depinde de starea de sanatate a pacientilor si de durata infectiei, boala putand fi fatala pentru persoanele cu un status imun scazut.

Simptomele sunt urmatoarele :

-dureri abdominale si crampe;

-greturi si vomismente;

-febra, frisoane si dureri de cap;

-hipertrofia ganglionilor limfatici;

Sunt putine persoane care au trei dintre aceste simptome sau pe toate Aproape 10% din persoanele infectate dezvolta sindrom hemolitic si uremic (SHU)

Simptomele sunt foarte severe acolo unde persoanele infectate au un sistem imunitar foarte scazut si asupra persoanelor foarte tinere. Copii infectati cu aceasta bacterie sunt mult mai sensibili in contactarea sindromului hemolitic si uremic decat adultii cu o sanatate buna.

Infectia poate fi transmisa de la o persoana la alta [13].

4.1.1 Mecanismul patogenitatii 

a) Aderenta E.coli O₁₅₇ :H₇ prezinta proteine speciale care permit aderenta bacteriei la mucoasa intestinala fara a fi spalata si eliminata.

b)Toxigeneza O data ce adera la suprafata, bacteria secreta o toxina, de culoare verde inchis, care distruge mucoasa intestinului. Toxina se leaga de celulele intestinale ale gazdei. c) Efectul toxic Celulele afectate de toxina sunt distruse, celulele intestinale moarte sunt eliminate producand diaree hemoragica la gazda [14].

Perioada de incubatie obisnuita este de 3-9 zile, cu o medie de 4 zile. Doza minima infectanta pentru om este foarte mica. In general, se accepta ca aceasta doza este mai mica de 1000 celule de microorganisme sau , dupa unii cercetatori, mai mica de 100.

In marele episod alimentar cu E.coli O₁₅₇:H₇ din SUA, din 1993- 1995, numai 40 bacterii/g au produs boala, iar intr-un episod din Tara Galilor, s-au evidentiat numai 2 bacterii in 25g de carne tocata de vita care a stat la originea imbolnavirilor [15].

Infectia cu E.coli O₁₅₇ :H₇ poate avea multe aspecte, dar are ca urmare intotdea- una acelasi mecanism de patogeneza:

4.1.2

Forme asimptomatice si diaree nehemoragicǎ

Aceasta forma este greu de descoperit pentru ca boala nu prezinta nici un simptom intalnit in general si de aceea pacientii nu vor consulta un medic. Un studiu arata ca serotipul E.coli O_157:H₇ se gaseste la copii, prezent printr-o simpla diaree.

Colita hemoragica

Este principala manifestare clinica a infectiei cu E.coli. Acest simptom a fost descris pentru prima data in 1971, se caracterizeaza prin aparitia brusca a durerilor si crampelor abdominale urmate, in decurs de 24 de ore de diaree apoasa care ulterior devine puternic hemoragica. Pot sa apara vomismente, dar ele sunt in cantitate mica si fara febra. Durata bolii este de 2-9 zile, cu o medie de 4 zile si in majoritatea cazurilor cu o ingrijire adecvata, se remite fara urmari. La 10% din pacienti, colita sau enterocolita hemoragica se complica cu sindromul uremic si hemoragic sau cu purpura trombocitopenica trombotica.

La anumiti bolnavi, s-a observat liza intravasculara a hematiilor si de asemenea o trombopenie (deficit de plachete sangvine). La examenul radiologic, s-a observat edemul pronuntat al submucoasei intestinale cu spasm si cresterea presiunii in colonul ascendent si transvers. Sigmoidoscopia arata ca mucoasa este hiperemiata moderat. Boala in cele mai multe cazuri se vindeca spontan.

Colita sau enterocolita hemoragica se poate diferentia de disenteria descrisa in sigeloza, de enteritele amibiene, campilobacteriene sau de gastroenterita produsa de EIEC, prin lipsa febrei si eliminarea sangelui asemanatoare unei hemoragii gastrointestinale [2,9].

Sindromul hemolitic si uremic (S.H.U) 

Sindromul hemolitic si uremic a fost descris pentru prima data in 1955, el a afectat in principal copiii mici. S.H.U apare la aproximativ 10% din pacientii infectati cu E.coli O_157:H₇ si este deseori fatal. Desi acest sindrom poate avea si alte cauze, merita subliniat faptul ca numerosi autori considera ca E.coli O_157:H₇ ca fiind cea mai frecventa dintre ele. El este precedat de diaree hemoragica la 90% dintre bolnavi.

Acest sindrom este caracterizat de trei simptome evidente :

.Anemie hemolitica microangiopatica, consecinta coagularii eritrocitelor lezate mecanic prin comprimarea lor de vasele cu lumenul foarte micsorat.

.Trombocitopenie

. Tulburari renale, sub forma unei nefropatii acute cu insuficienta renala, ceea ce impune supravegherea medicala prin internare, dializa si transfuzie de sange. Bolnavii prezinta paloarea fetei si fac foarte usor pete violacee la nivelul pielii, la cea mai mica lovitura. In general acest sindrom este cauza principala a insuficientei renale a copiilor. Ei elimina o cantitate mica de urina, ceea ce se accentueaza pe masura ce functia renala scade, lichidele se acumuleaza in organism si provoaca edeme in jurul ochilor si articulatiilor [33].

Simptomele S.H.U. apar brutal la o saptamana dupa colita hemoragica. Intre 2-7% dintre persoanele afectate de E.coli O₁₅₇ :H₇ au dezvoltat S.H.U. Aceste cifre sunt crescute la copii sau persoane in varsta. La aceste categorii se intalnesc dese cazuri mortale.

Rinichii nu sunt singurele organe care pot fi afectate :

-Intestinul gros ( 10-20% din cazuri)

- Pancreasul ( 20% din cazuri) cu aparitia unei pancreatite severe

-Sistemul nervos central ( 20% din cazuri) cu aparitia de sechele neurologice

( marea majoritate a copiilor nu prezinta).

- Inima ( in mai putin de 1% din cazuri)

Deseori acest simptom este asociat cu E.coli O_157 :H₇ dar nu este singura cauza. Merita retinut ca in unele tari europene s-au semnalat SHU produs de alte serotipuri de E.coli (ex. O₁₁₁) [2,9].

Purpura trombotica trombocitara (P.T.T) 

Purpura trombotica trombocitara a fost descrisa pentru prima data in 1925. Ea afecteaza in majoritate adultii, fiind o tulburare grava, multe cazuri fiind mortale. Poate fi cauzata si de alti agenti microbieni. Bolnavii prezinta numai rareori diaree si dureri abdominale inainte de aparitia semnelor de P.T.T.

P.T.T. este caracterizata de :

- Anemie hemolitica microangiopatica

- Trombocitopenie

- Febra

- Tulburari neurologice, care sunt obisnuite, datorate unor hematoame in encefal, acompaniate de o insuficienta renala acuta.

Acest sindrom dureaza in general intre cateva zile si cateva saptamani , dar se poate prelungi luni de zile si se intalneste mai ales la batrani.

Imbolnavirile produse de E.coli O_157:H₇ se pot manifesta si sub alte forme cum ar fi diareea nehemoragica, cistita hemoragica si balanita [2,9].

4.2 Factori de virulenta 

In cazul E.coli O_157:H₇ cu mult timp in urma celulele se pare ca au fost infectate cu un bacteriofag. Acest virus particular a fost capabil sa introduca ADN-ul in cromozomul bacteriei (care s-a integrat la acest nivel)

O data cu replicarea bacteriana , ADN-ul viral se replica cu cel bacterian, trece in fiecare celula fiica rezultand E.coli O_157:H₇ . Aceasta informatie genetica virala (gena) codifica sinteza unei toxine Shiga-like(SLT), numita, Vero-toxina. In consecinta aceast serotip si toti descendentii sai, produc aceasta toxina. Aceasta este o proteina care produce severe modificari in celulele epiteliului intestinal [1, 16].

Serotipul de E.coli O₁₅₇ :H₇ i-si datoreaza virulenta sintezei a trei factori diferiti :

4.2.1 Toxinele Shiga-like(SLT) sau verotoxinele (VT),

factori citotoxici si necrozanti 

Toxina "Shiga" a fost descoperita in 1903 de Conradi la Shigella dysenteria serotip 1 si s-a considerat mult timp ca o neurotoxina, entero- toxicitatea ei fiind pusa in evidenta abia in 1972. Ulterior s-a descoperit ca unele

tulpini de EHEC produc o toxina analoaga toxinei Shiga, cu propietati citolitice pentru linia de culturi celulare Vero (celule renale ale maimutelor verzi din Africa). Aceasta toxina s-a numit verotoxina sau VTEC.

Exista 2 tipuri de toxine stx1 si stx2. Stx1 are un procentaj de 99% de omologie cu Shigella dysenteriae de tip 1, pe cand stx2 nu poseda decat 56%. Aceste toxine sunt codate de gene de origine virala. Toxina Shiga e compusa din 5 subunitati B si o subunitate A. (Fig.13)

Totusi in 1982, O.Brien si colaboratorii produc o citotoxina a carei activitate este neutralizata de anticorpii antitoxina Shiga si au propus sa fie numita toxina Shiga-like. Cele doua tipuri de toxine (verotoxine si toxina Shiga-like) sunt identice si cei doi termeni trebuie sa fie considerati sinonimi. Toxinele produse de E.coli O₁₅₇:H₇ se numesc verotoxine (VT) sau toxine Shiga-like (SLT) si sunt in numar de trei :VT (SLT)₁, VT (SLT)₂ si VT (SLT)₃. In functie de tulpina, bacteria poate elabora una, doua sau toate toxinele.

4.2.1.1. Structura proteinelor si a toxinei

Toxina este de natura proteica. Aceasta proteina este un lant de aminoacizi, formand o structura tridimensionala.

Eliciile alfa (Fig.9) sunt infasurate in structura proteinei. Oxidul de carbon CO formeaza o legatura H cu peptida NH a patru acizi aminati situati in aval. Ansamblul structurii are o forma aproximativ ciclica cu lanturile laterale de acizi aminati (R) impinse in exterior.

File beta, sunt tipuri comune din structura secundara. Lanturile de acizi aminati orientati in structura pliata seamana cu niste file. Numeroasele lanturi care se gasesc unul langa altul formeaza veritabile file beta (Fig 10) [17].

Fig.9: Elicele alfa

Fig.10 :File beta

Toxina E.coli O₁₅₇ :H₇ (Fig.11) este o proteina compusa dintr-o subunitate A si cinci subunitati B (Fig.12) [17].

Fig.11:Toxina E.coli O₁₅₇ :H₇

Fig.12 : .Proteina toxinei formata dintr-o subunitateA si 5B

4.2.1.2.Mecanismul de actiune al toxinei Shiga se desfasoara in sase etape

Sinteza si excretia toxinei in mediul exterior

Fixarea subunitatii B pe receptorul Gb3 (globotriosilceramida-glicozida membranara a celulelor) la suprafata celulei tinta.

Patrunderea toxinei prin endocitoza

Transportul , tranversand aparatul Goligi apoi reticulul endoplasmatic la subunitatea A taind in doua parti A1 si A2.

Translocatia partii A1 in citoplasma celulei

Inhibitia sintezei proteice datorita activitatii N-glicozidice a subunitatii A1 asupra ARN ribozomal 28S, blocand astfel alungirea peptidica [9].

Astfel, din moment ce toxina se ataseaza de receptorul celular prin subunitatea B, subunitatea A a toxinei intra in celula si inhiba sinteza proteica antrenand in unele cazuri moartea celulara.

Aceste toxine sunt responsabile de alterarea celulelor renale, a sistemului nervos central, a endoteliumului vascular. Asadar toxina stx2 este mult mai activa decat toxina stx1 [15].

Inocularea la soareci pe cale i.v a verotoxinelor : acestea se localizeaza in intestin dar si in maduva spinarii si creier, in general in toate organele care poseda situri sau receptori de atasare a verotoxinelor. Bolnavii care prezinta SHU au leziuni renale care se regasesc des in alte organe ca pancreasul si creierul. S-a emis ipoteza ca aceste efecte sistemice ale verotoxinelor asupra organelor indepartate ar putea rezulta dintr-o diseminare sangvina a verotoxinelor la nivelul acestor organe vitale. Totusi, pana in prezent nu exista dovezi evidente asupra prezentei verotoxinei in sangele pacientilor afectati de infectii cu VTEC sau aparitia de complicatii grave. In anii trecuti se foloseau celule Vero pentru a demonstra efectul patogen al verotoxinelor; acum se folosesc si alte linii celulare, in laborator, pentru a studia propietatile verotoxinelor. Una din liniile celulare folosite in prezent este linia HUVEC (human Umbilical Vein Endothelial cells). Acest tip de linie este folosit datorita propietatilor ei similare cu cele ale celulelor umane afectate in cazul infectiei cu VTEC [2,15].

4.2.2. Factorul de atasare si de distrugere 

Aderenta E.coli O₁₅₇:H₇ de celulele intestinale poate fi un aspect important pentru potentialul patogen al bacteriei. Indivizii cu colita hemoragica provocata de aceasta bacterie, prezinta, in mod caracteristic, febra slaba sau sunt afebrili, ceea ce sugereaza ca agentul etiologic nu este invaziv si ca nu patrunde in sistemul circulator. De aici s-a dedus ca bacteria colonizeaza tractul intestinal, elaboreaza toxinele, care apoi actioneaza asupra colonului [2].

STEC are capacitatea de a provoca leziuni de tip atasare-distrugere in colon si in cecum. Aceste leziuni se caracterizeaza prin stergerea microvilozitatilor in locul unde se fixeaza bacteria, aceasta fiind cauza diareei pentru ca se diminueaza suprafata de absorbtie a apei la acest nivel.

STEC poseda gena eaeA localizata pe cromozom. Aceasta codifica o proteina, « intimina » care provoaca o acumulare de microfilamente de actina, in zonele de contact intre celule si bacterii producand leziuni A/E in mucoasa intestinala.

In timpul atasarii, celula se comporta ca un adevarat soclu foarte solid pentru bacterie. In zilele care urmeaza atasarii, bacteria patrunde in spatiile intercelulare provocand o ulcerare, tumefiere a tesuturilor atinse si distrugerea microvilozi- tatilor [9].

Enterohemolizina

Enterohemolizina (E-hlyA) a fost pusa in evidenta la STEC pentru prima data in 1988. E-hlyA este o hemolizina care are aceeasi actiune ca si 1'α hemolizina E.coli. Este o proteina care formeaza pori in membrana plasmatica a hematiilor inducand liza prin socul osmotic. Bacteriile se servesc de fierul continut in hematii pentru a ameliora cresterea lor. Acest factor de virulenta este mult mai important decat precedentele. Este prezent intr-o plasmida pe care doar 18-48% de STEC o poseda [9].

Legatura intre infectie si aparitia bolii 

SHU si TTP pot avea si alte origini decat infectioase (toxice, autoimune), dar in general un SHU precedat de o colita hemoragica denota o infectie cu VTEC. Totusi in 10% din cazuri, SHU nu este precedat de diaree hemoragica, mecanismul nefiind astazi cunoscut. In 1989, Karmali si col. au putut arata legatura infectiei cu VTEC si aparitia SHU « idiopatic ».  In prezent se stie ca si alti factori de virulenta sunt necesari la tulpinile patogene (atasare/ stergere, hemolizine) si ca propietatea de a produce verotoxine poate exista si la unele tulpini din alte specii bacteriene [15].

Originea si genetica patogenitatii 

Factorii patogenitatii STEC nu sunt de origine bacteriana. STEC are un genom in jur de 5,5.10³ kb pe cand tulpinile E.coli nepatogene au genomul in jur de 4,6.10³ kb. Acesti factori diferiti se pot gasi fie incorporati in genom fie inclusi intr-o plasmida putand avea diferite origini [9].

Genetica patogenitatii:

4.3.1.1.Bacteriofagii

Se stie ca genele codate pentru sinteza toxinei Shiga sunt transduse de bacteriofagii lisogeni. Toxinele Stx1 si Stx2 sunt transportate de doi fagociti diferiti. Stx1 este adusa de fagul H-19B care a fost identificat la serotipul O₂₆:H₁₁, asemanator morfologic cu fagocitul λ. Gena codata pentru Stx2 este adusa de catre fagocitul 933W care seamana de asemenea cu fagocitul P22. Toate fagocitele care aduc genele Stx, conserva aceeasi organizare genomica:

-o regiune implica in morfologia fagocitului

-o zona care sa permita mecanismul de recombinare, apoi de reglare ,replicare.

-o regiune implicata in etapa de liza: aceasta regiune cuprinde genele stx [9].

4.3.1.2 Zonele responsabile (insulele) 

Insulele de patogenitate sunt definite prin urmatoarele particularitati :

ele sunt in totalitate absente de bacterii nepatogene de la aceasi specie

sunt constituite dintr-un grup de gene virulente

se aseaza in apropierea unei gene codate pentru un ARN si pentru o noua secventa de insertie

procentajul de G+C este diferit de restul cromozomului

L.E.E (locul enterocitelor distruse) este compus din 5 parti implicate in formarea leziunilor de distrugere si atasare. Dimensiunea sa este de 43,4 kb [9]

Plasmidele 

E.coli O₁₅₇ :H₇ poseda o plasmida de 92 kb numita pO157, care poseda douazeci de gene cu potential virulent.

4.3.2 Originea E.coli O_157 :H₇ 

Multe ipoteze au fost emise referitor la originea E.coli O₁₅₇ :H₇, majoritatea sustin ca tulpinile sunt derivate ale tulpinilor E.coli enterohemoragice. Doar cativa autori, sustin ca E.coli O₁₅₇ :H₇ este un EPEC al serotipului O₅₅ :H₇. Acesta avea sorbitol (+) si β-glucuronidaza (+) si poseda deja o insula de patogenitate L.E.E. Avea intr-o prima faza dobandita gena codata pentru Stx2. Intr-o a doua faza ea a obtinut plasmida care poarta gena codata pentru hemolizina-α si gena rbf, aceasta din urma codata de serotipul O157. De asemenea pentru transformarea dintr-un fagocit, a obtinut gena codata pentru Stx1. La sfarsit a pierdut caracterul β-glucuronidazic dupa o mutatie in gena uidA si a dobandit plasmida pO157 [9].

5. Diagnostic de laborator si tratament 

Fig.17 : E.coliO157:H7

5.1 Diagnosticul  poate fi pus pe prezenta VTEC in fecale in faza diareica. Bacteriile pot fi excretate in fecale pe o perioada scurta. Punerea in evidenta a anticorpilor dirijati contra lipopolizaharidului furnizeaza dovada unei infectii recente.

Majoritatea laboratoarelor din spitale testeaza aceasta bacterie, in special daca individul posibil infectat are diaree hemoragica. Ramane inca o buna metoda sa se testeze fecalele pe agar Mac Conkey cu sorbitol pentru a detecta prezenta E.coli O₁₅₇ :H₇.

In completare Marler Clark [18] scrie ca aceasta bacterie este usor de identificat, printr-o alta metoda, cea a amprentei ADN. Se recolteaza o proba din bucata de carne de vita sau pasare contaminata cu E.coli O₁₅₇ :H₇, listeria sau campylobacter, apoi este cultivata si identificata prin izolare. Daca o persoana consuma carne de vita sau de pasare contaminata si devine infectata, ca rezultat, monstra de fecale poate fi apoi cultivata pentru a obtine si identifica bacteria izolata. Aceste bacterii sunt apoi divizate in componente diferite rezultand o « amprenta » ADN. « Amprenta » bacteriei poate fi comparata si potrivita cu amprenta celei izolate de la persoana care a consumat produsul contaminat. Cand amprenta ADN se potriveste, se dovedeste ca produsul conta- minat a fost sursa bolii.

Procesul de obtinere al « amprentei » ADN se numeste Pulse Field Gel Electrophoresis sau PFGE. Aceasta metoda este folosita pentru a separa ADN-ul bacteriei izolate in parti componente. Opereaza cauzand campuri elecrice pentru a trece ADN-ul printr-o matrice din gel fin al agarozei, un polizaharid obtinut din agar. Originea benzilor fragmentelor de ADN sau « amprentele » in gel, dupa expunerea la curentul electric, este unica pentru fiecare tulpina si subtip al bacteriei. Folosind aceasta procedura cercetatorii pot identifica sute de tulpini E.coli O₁₅₇ :H₇ ca si tulpini de listeria sau campylobacter [18].

5.2 Tratament 

Nu exista un tratament specific si eficient al imbolnavirilor produse de E.coli prin consumul alimentelor. Toate aceste imbolnaviri se manifesta prin diaree care produce deshidratarea de diferite grade de severitate. De aceea, pe langa dieta alimentara adecvata, rehidratarea organismului este prima si cea mai importanta terapie. Aceasta se poate face oral, prin administrarea de ceaiuri, in special a celor care au si actiune antiseptica intestinala sau intravenos prin inocularea solutiilor glucozate rehidratante. Din aceasta cauza unii bolnavi au nevoie de spitalizare.

Unele imbolnaviri produse de E.coli, mai ales cele determinate de E.coli O₁₅₇:H₇, deseori nu se diagnostica corect si se confunda cu apendicita sau cu tulburari gastrointestinale acute produse de alte cauze. De aceea, un aspect important al ingrijirii clinice este punerea unui diagnostic corect prin care sa se evite interventiile neadecvate [8].

E.coli este, in general, sensibila "in vitro" si "in vivo" la numeroase substante antimicrobiene .Ele au fost si sunt folosite cu mult succes in multe imbolnaviri produse de E.coli non O₁₅₇. In ceea ce priveste infectiile cu E.coli O₁₅₇:H₇, pana in prezent nu exista dovezi certe ca terapia cu aceste substante ar reduce severitatea bolii sau ar preveni aparitia complicatiei SHU sau TTP. Din contra, unele studii retrospective au demonstrat ca la pacientii care au fost tratati cu medicamente antimicrobiene s-a inregistrat o rata mai mare de mortalitate. Aceste studii nu arata daca agentii antimicrobieni au avut un efect secundar sau rata mai mare de mortalitate constatata a fost o consecinta a faptului ca ele s-au folosit numai la pacientii cu formele cele mai grave de boala [2].

Explicatia pentru lipsa de beneficii ale tratamentelor cu antibiotice ar fi:

1) eliminarea florei intestinale de catra antibiotice, dand astfel bacteriei E.coli O₁₅₇:H₇ avantaje competitive si

2) liza/moartea fondului E.coliO₁₅₇ prin cresterea relatiilor cu verotoxinele [21].

Folosirea absorbantilor toxinelor Shiga-Like din tractul gastrointestinal s-a facut in mica masura, iar studiile care se executa in prezent in aceasta directie nu au putut formula niste concluzii.

S-a stabilit ca medicatia inhibitoare a motilitatii intestinale este vatamatoare, motiv pentru care ea nu trebuie folosita in aceste imbolnaviri.

SHU este o complicatie severa a diareei produsa de E.coli O₁₅₇:H₇ si pana in prezent nu se cunosc mijloacele de prevenire a ei. De aceea, totul se limiteaza la tratarea bolnavilor prin dializa si transfuzii de hematii si trombocite [2,8]

Medicamente ce trebuie evitate :

Majoritatea adultilor fara alte probleme medicale care fac infectie cu E.coli O₁₅₇ :H₇ se vindeca in 5-10 zile fara tratament medicamentos. Antibioticele nu sunt de obicei recomandate. Medicamentele antidiareice nu se utilizeaza pentru tratarea infectiei cu E.coli. Multe antidiareice incetinesc tranzitul intestinal, ceea ce determina stationarea alimentelor in intestin. Aceasta permite ca din intestin sa se absoarba o cantitate mai mare de toxine produse de E.coli datorita reducerii tranzitului intestinal, crescand astfel riscul complicatiilor precum tulburarile hematologice severe sau alterarea functiei renale. Trebuie evitate urmatoarele medicamente antidiareice:

-produse care contin clorhidrat de loperamid Acestea includ Imodium, Imodium A-D, Maalox Antidiareic, Kaopectate II.

-produsele care contin salicilati. Acestea includ Pepto -Bismol si produse similare antidiareice pe baza de bismuth, aspirina si ibuprofen (Advil). Salicilatii pot creste sangerarea la nivel intestinal [19].

Compania biofarmaceutica Bioniche din Canada a primit pe data de 24 decembrie 2006 autorizatia de la Canadian Food Inspection Agency (CFIA) de a distribui vaccinurile sale pentru vaci impotriva E.coli O₁₅₇ :H₇ veterinarilor canadieni. Aceasta autorizatie este egala cu o "licenta conditionata " in U.S. Aceasta este prima tehnologie de vaccin pentru controlul E.coli O₁₅₇ :H₇ care va fi autorizat la nivel global. Vacinul este recomandat pentru reducerea bacteriei E.coli O₁₅₇ :H₇ la vite.

Pentru a progresa si a primi o licenta completa, CFIA a indicat ca Bioniche trebuie sa dovedeasca cat mai repede reducerea E.coli O₁₅₇ :H₇ prin vaccinarea animalelor. Compania crede ca aceasta cerinta va fi indeplinita in 2007.

Incercarile clinice facute de catre companie au implicat mai mult de 30 000 de vaci, dea lungul ultimilor patru ani Studii serioase au aratat o scadere semnificativa a numarului vitelor care poseda aceasta bacterie mortala in fecale [20].

Epidemiologie 

6.1 Episoade de toxiinfectii alimentare produse de E. coli O₁₅₇:H₇  si alimente responsabile 

Pana in prezent literatura de specialitate a semnalat un numar redus de imbolnaviri la om provocate de E.coli O₁₅₇:H₇, desi conform cunostintelor actuale patogenitatea acestui serotip este foarte ridicata. Aceasta se datoreste in primul rand faptului ca acest serotip nu a fost indeajuns cunoscut, iar cea mai mare parte din imbolnavirile produse de el au fost incadrate in marea grupa de E.coli enteropatogen (EPEC).

Gratie internetului insa, si tehnologiei avansate de laborator putem afla numarul de victime, actualizat, al acestei bacterii si incidenta acesteia in ultimii ani.

E.coli O₁₅₇:H₇ se gaseste relativ rar in alimente. In SUA s-au efectuat mai multe investigatii pentru stabilirea incidentei acestei bacterii in alimente si s-a constatat ca ea contamineaza foarte rar asemenea produse. Din cateva mii de probe de carne de bovine examinate au fost contaminate numai cateva probe. Astfel in perioada ianuarie 1987- martie 1990 din 1668 probe de carne dezosata cruda de vita s-au gasit E.coli O₁₅₇:H₇ numai la doua probe (0,1%) . In octombrie 1992 examinandu-se probe de carne de vita din 110 unitati de prelucrare si comercializare din SUA , nu s-a constatat bacteria la nici o proba [10].

In Canada s-au gasit pozitive pentru aceasta bacterie 5-40% din probele de hamburger si la aproximativ 4% din probele din lapte materie prima examinata. Alte investigatii intreprinse in SUA au evidentiat prezenta E.coli O₁₅₇:H₇ la 0,1-3,7 % din probele de carne tocata de vita, la 0,7% probe de rinichi de vitel, la 1,5 % probe de carne de pasare , de porc si miel.

In urma episoadelor aparute in 1992-1993 in patru state , Food Safety and Inspection Service (FSIS), Food and Drug Administration si Centers for Desease Control (CDC) au stabilit masuri speciale de investigare si supraveghere a acestei bacterii in produsele alimentare si au pus la punct metode de lucru adecvate. In acelasi timp, au recomandat tuturor tarilor care au schimburi comerciale cu ele sa implementeze programe speciale de supraveghere a E. coli in carne, in special pentru carnea de vita [10].

Primul episoad de imbolnaviri produse de E.coli O₁₅₇:H₇ s-a identificat in SUA in 1982. Imbolnavirile erau determinate de consumul de hamburger insuficienti tratati termic pentru a inactiva sau omora coliformii si s-au manifestat prin diaree hemoragica severa si prin sindrom hemoragic si uremic. Cu acea ocazie s-au diagnosticat trei focare de boala in Michigan, Oregon si Ontoric. Focarele din Michigan si Oregon au fost provocate de consumul de hamburger de la restaurante cu autoservire. Focarul din Ontoric interesa un camin de batrani, s-a datorat consumului de sandwich-uri cu semipreparate din carne si a inregistrat 19 cazuri mortale. Investigatiile facute cu aceasta ocazie au demonstrat ca boala se poate transmite si de la persoanele bolnave la cele sanatoase. In general carnea este implicata in aceste accidente cand este insuficient fiarta sau este mentinuta un timp indelungat la o temperatura care permite multiplicarea bacterie [15].

In 1984 au aparut inca doua focare majore, in 1985 unul si trei in 1986.

In octombrie-noiembrie 1986 a aparut un focar de colita hemoragica in localitatea Walla Walla din statul Washington. El a interesat 37 de persoane cu varste diferite (11 luni la 78 de ani), care au prezentat diaree, din care 36 cu crampe abdominale si scaune hemoragice urmate de sindrom hemoragic si uremic la o persoana si de purpura trombotica trombocitopenica cu sfarsit letal la 2 persoane. Imbolnavirile au aparut dupa consumul carnii tocate de vita.

Laptele crud de vaca nu s-a citat ca sursa de contaminare decat dupa 1986 [15].

In Canada doua grupe de persoane sunt expuse unui risc mai mare de contaminare: copii din centrele de supraveghere zilnica si persoanele varsnice din caminele de pensionari. Astfel aproape 45% din accidentele alimentare survin in caminele de pensionari, 15% din centrele de supraveghere zilnica si restul este reprezentat de accidentele familiare.

Cel putin o situatie de infectie cu E.coli O₁₅₇ :H₇ a interesa 38 de copii care locuiau intr-un sat izolat din Nordul Canadei. Concluziile au sugerat ca ar fi fost o transmitere interfamiliara mai degraba, decat de origine exclusiv alimentara [15].

Un episod important a evoluat in Missouri intre decembrie 1989 si ianuarie 1990 si a fost atribuit apei de baut. E.coli O₁₅₇ :H₇ nu a putut fi izolata din probele de apa analizate, dar numarul de cazuri de boala a scazut spectaculos dupa clorinarea apei. De aceea Swerdlow si col. au emis ipoteza unei contaminari a apei de scurgere in timpul reparatiilor de canalizare [10].

Un alt caz de toxiinfectie alimentara si de SHU a fost citat in Massachusetts in 1991. Boala era asociata cu ingerarea unui suc de mere nefermentat, asemanator cu sucul de fructe din Franta, cu deosebirea ca merele sunt adunate de pe sol si nu sunt deloc spalate inaintea folosirii lor. Pe de alta parte acest suc de mere nu era pasteurizat si nu continea conservanti. Studii complementare au aratat ca E.coli O₁₅₇ :H₇ este capabila a supravietui in sucul de mere refrigerat cu pH mai mic de 4, timp de mai multe zile. In acelasi an (1991), in Anglia, s-a izolat din iaurtul din lapte crud, o tulpina de E.coli O₁₅₇ :H₇, la originea imbolnavirii a 49 de persoane din care 11 erau copii mai mici de 10 ani, cinci din acesti copii au manifestat SHU [34].

In S.U.A din 15 noiembrie 1992 pana in februarie 1993 s-au confirmat la laborator mai mult de 500 de imbolnaviri produse de E.coli O₁₅₇:H₇ din care patru cu sfarsit letal. Aceste imbolnaviri au aparut in patru state: Washington, Idaho, California si Nevada. Din 477 de personae bolnave, 52 (11%) s-au contaminat ca urmare a contactului cu personae bolnave. Din restul de 425 de personae, 372 (88%) s-au imbolnavit in urma servirii mesei de la o serie de restaurante din care 312 (92%) au consumat hamburger. Din cei 477 bolnavi, 144 (30%) au fost spitalizati, iar 30 au contactat sindromul hemoragic si uremic si trei au murit. Anchetele efectuate au scos in evidenta ca sursa de contaminare au constituit-o hamburgerii tratati insuficient termic in restaurante, iar carnea provenea de la un singur producator [10].

In febuarie1993, s-au descris primele focare in Franta, unde pana atunci nu s-au intalnit decat cazuri sporadice.

Pentru a ilustra extrema varietate de alimente care pot fi responsabile de contaminarea cu acestǎ bacterie citam maioneza care a determinat in SUA in 1993 numeroase cazuri de SHU. Weagant si col. au demonstrat ulterior capacitatea E.coli O₁₅₇ :H₇ de a supravietui un timp scurt intr-o maioneza stocata la 25sC si pe perioade lungi cand aceasta maioneza era stocata la temperatura de refrigerare [37].

O alta sursa de contaminare a fost reprezentata de produse vegetale (salata). Acest accident a aparut in Matore si interesa o familie al carei obiceiuri culinare consta in a consuma legume produse numai in gradina propie, care erau fertilizate cu balegar de vaca. Desi nu s-a izolat bacteria in probele de fecale, animalele de la care provenea balegarul prezentau titruri mari de anticorpi anti E.coli O₁₅₇ :H₇. De mentionat ca bacteria a putut fi izolata din solul fertilizat din gradina [15].

Supravietuirea si cresterea E.coli O₁₅₇:H₇ in varza data prin razatoare, in castravetii feliati, in morcovul taiat, este influentata de modificarile atmosferice si de temperatura.. Daca sunt ambalate la o atmosfera care contine 3% oxigen si 97% azot nu se observa nici un efect asupra contaminarii cu E.coli O₁₅₇:H₇. Populatia de bacterii scade in depozitele unde temperature e de 5sC si creste la leguminoasele inmagazinate la 12-21sC mai mult de 14 zile. Cea mai rapida crestere a populatiei de E.coli O₁₅₇ :H₇ are loc la varza si castravetii depozitati la 21sC. Acest rezultat sugereaza ca un factor inca necunoscut asociat cu morcovul poate inhiba cresterea E.coli O₁₅₇ :H₇. Reducerea pH legumelor este corelat cu cresterea populatiei E.coli O₁₅₇ :H₇. Eventualele scaderi ale populatiei bacteriei in probele prelevate de la 21sC, sunt atribuite efectului toxic al acumularii de acizi. Nu s-au semnalat modificari ale aspectului legumelor datorate dezvoltarii E.coli O₁₅₇ :H₇ [22].

Importanta Epidemie majora din Japonia din iulie 1996 a interesat 9000 de bolnavi din care 6000 copii scolari din orasul Sakai si 2000 copii din cresele din Habikino langa Osaka. Noua copii au murit in urma sindromului hemoragic si uremic. Alimentul incriminat nu a fost inca identificat. Totusi exista prezumtii serioase ca a fost vorba de ridichi de luna cultivate intr-o ferma din Habikino [15].

E.coli O₁₅₇ a fost descoperita pe rafturi, pereti si in praful din cladirile dintr-un oras cu targ de animale, si a determinat imbolnavirea oamenilor din Ohio in 2001. Se pune intrebarea daca calea de transmitere a infectiei a fost aerul [23].

In iunie-iulie 2002 s-a produs in Brooks (Alberta - cu 12 000 de locuitori) o toxiinfectie cu E.coli O₁₅₇:H₇ la un camin pentru copii. Un copil de 3 ani pe data de 4 iunie 2002 prezenta diaree hemoragica, febra si vomita. Simptomele sale au evoluat spre un sindrom uremic si hemolitic, necesitand internarea in spital si o dializa renala. Coprocultura efectuata in timp ce copilul era sub tratament cu antibiotice a fost negativa pentru E.coli O₁₅₇:H₇ [13].

28 februarie 2005 in Washigton: Department of Agriculture's Food Safety and Inspection Service (FSIS) a aratat ca a scazut procentul probelor de carne contaminate cu E.coli O₁₅₇:H₇ cu 43,3% colectate in 2004 in comparative cu anul precedent. Din 8010 probe colectate si analizate in 2004 au fost gasite pozitive doar 0,17% , 0,30% in 2003, 0,78% in 2002, 0,84% in 2001, 0,86% in 2000. Intre 2000 si 2004 procentul probelor pozitive a scazut cu mai mult de 80. In 2004 Centrul de Prevenire si Combatere a Bolilor a raportat o reducere cu 36% a imbolnavirilor cu E.coli O₁₅₇:H₇ in 2003 in comparatie cu 2002. Au fost raportate doar 6 cazuri de boala in 2004 in comparatie cu 2003 cand erau 12 si in 2002 cand s-au raportat 21 de cazuri. Se pare ca reducerea cazurilor pozitive cu E.coli O₁₅₇:H₇ se datoreaza masurilor luate de autoritati [24].

Fig.18

In intervalul 2004-2005 cazuri de infectiei cu E.coli O₁₅₇ :H₇ au aparut in imprejurimile targurilor de vite, festivalurilor si in gradinile zoologice in Nordul Carolinei , Florida si Arizona. 108 cazuri incluzand 15 cazuri de sindrom uremic si hemolitic au fost semnalata in Nordul Carolinei; 63 de cazuri incluzand sapte cazuri de SHU in Florida si doua cazuri au fost raportate in Arizona.

Nordul Carolinei : pe 29 octombrie 2004 s-au raportat trei cazuri de SHU la copiii care au vizitat gradina zoologica din Nordul Carolinei in cadrul unui targ organizat. Aproximativ 800,000 de persoane au vizitat acest targ intre 15 si 24 octombrie 2004. Targul a avut si doua gradini zoologice.

Cercetarile au relevat 108 persoane care s-au imbolnavit, dupa acest targ. Media de varsta a fost intre 5 si 61 de ani, dintre care 64 au fost femei. 52 de persoane au prezentat diaree hemoragica si 48 febra. In 41 de cazuri s-a confirmat la laborator STEC - Shiga toxin, iar la 38 de persoane s-a identificat aceeasi tulpina de E. coli O157:H7 (prin electroforeza). 12 pacienti au fost spitalizati si 15 au fost diagnosticati cu SHU.

Florida: in martei 2005, s-au identificat 22 de persoane infectate cu E.coli O₁₅₇ :H₇ in urma vizitarii targului de animale (oi, capre, vite).

Arizona: in iulie 2005, doi copii spitalizati au fost diagnosticati cu E.coli O₁₅₇ :H₇. Ambii copii au vizitat o gradina zoologica. Studiile au aratat ca 15 din 25 de animale de la zoo prezentau in fecale E.coli O₁₅₇ :H₇ . Dupa aceste rezultate oficialitatile au inchis imediat gradina zoologica [26]

In septembrie 2006, in SUA oficialitatile au fost alertate de o epidemi cu E.coli O₁₅₇ :H₇ in Wisconsin si Oregon cauzata de consumul de spanac proaspat. Pe 26 septembrie un total de 183 de persoane din 26 de state au fost infectate cu E.coli O₁₅₇ :H₇. Dintre aceste persoane, 95 (52%) au fost spitalizate, 29 (16%) au prezentat SHU, si o persoana a decedat. 130 de pacienti (95%) au consumat spanac proaspat cu cel putin 10 zile inainte de aparitia bolii [26].

Au fost semnalate cazuri de infectii in laborator cu E.coli O₁₅₇:H₇ . Investigatiile au relevat ca laborantii din diferite laboratoare clinice au fost infectati cu acelasi tip, acelasi ADN, al aceleiasi bacterii: O₁₅₇:H₇ pe care au izolat-o la locul de munca. Cazuri raportate au fost patru. Primul in septembrie 1999, in care o laboranta de 43 de ani a manifestat diaree hemoragica, febra si crampe abdominale la 3- 4 zile dupa ce a izolat o tulpina E.coli O₁₅₇:H_7. Al doilea caz a avut loc in 2000 cand o laboranta de 51 de ani a prezentat simptomele specifice acestei infectii. In 2003 are loc al treile caz de infectie intr-un laborator, de aceasta data este vorba de o laboranta de 26 de ani, iar al patrulea caz se petrece in martie 2004 ( o femeie de 45 de ani). Toate aceste cazuri se pare ca au survenit datorita nerespectarii normelor de protectie la locul de munca, ex : s-a vorbit la telefon si s-a scris la calculator cu aceleasi manusi utilizate la izolarea si identificare bacteriei [21,35].

In tara noastra nu sunt comunicate pana in prezent episoade de toxiiinfectie alimentara determinata de E.coli O₁₅₇:H₇, desi cercetarile intreprinse de Gancevici si col pe 91 de tulpini de E.coli izolate din fecalele a 465 bolnavi cu enterita, internati in doua spitale din Bucuresti, au scos in evidenta ca 13 (2,79%) tulpini erau enterohemoragice si apartineau serotipului O₁₅₇:H₇ [10].

Infectii ale serotipurilor non -O157

Exista peste 60 de non-O157 verotoxine care produc serotipuri. Rapoarte din alte tari au indicat ca serotipurile non-O157 sunt de asemenea importante cauze ale SHU. In 1995 a izbucnit SHU intr-o mare cumunitate din Australia afectand 23 de persoane, atribuit in principal serotipului O111:NM ( ne mobil). Boala a fost asociata consumului de carnati semi-umezi fermentati, nepreparati, produs preparat local. Prima izbucnire raportata a unui non O157 EHEC care a determinat colite hemoragice in U.S a fost in Montana in 1994. Infectia cu E.coli O104:H21 a fost confirmata in sapte cazuri de boala asociate cu consumul unei anumite marci de lapte.

Infectii cu serotipul non -O157 pot ramane neraportate deoarece izolarea lor cere tehnica care nu se gaseste in laboratoarele clinicilor. Majoritatea serotipurilor non-O157 fermenteaza sorbitolul de aceea nu se detecteaza pe agar Mac Conkey. Pentru a detecta aceste serotipuri trebuie intrebuintate teste speciale care identifica prezenta toxinei sau a genelor toxinelor [26,27].

6.2 Frecventa E.coli O₁₅₇ :H₇ si a VETC la animale si produse alimentare 

6.2.1 Frecventa la animale

Un studiu asupra E.coli izolata de la animalele bolnave in Anglia si Tara Galilor intre 1986-1991 realizat de Wray si col. a aratat ca 2,8% tulpini de origine bovina ; 6,1% de la ovine si 4% de la porc au produs verotoxine. Tulpinile de origine porcina apartineau serogrupurilor O₁₃₈,O₁₃₉ si O₁₄₁, obisnuit asociate cu boala edemelor [15].

VTEC au fost izolate de asemenea din tractul gastro intestinal al animalelor sanatoase. Intr-un studiu efectuat in SUA, VTEC a fost pus in evidenta la 8,4% din vacile de lapte sanatoase si 19%din juninci si vitei. Rezultate asemanatoare s-au obtinut intr-un studiu canadian care arata ca proportia animalelor infectate variaza de la 0 la 60% la vaci si de la 0 la 100% la vitei. Tulpinile VTEC izolate in aceste diferite studii apartineau diferitelor serogrupe, unele dintre ele cunoscute ca patogene pentru om. Aceste rezultate sugereaza ca bovinele constitue un rezervor pentru difuzarea VTEC. In afara VTEC, numeroase studii s-au referit numai la O₁₅₇ :H₇. A fost izolata de la animale aparent sanatoase si mai precis de la vitei de lapte si vaci lactante. Dupa Garber si col., viteii dupa intarcare ar fi de 3 ori mai susceptibili de a fi purtatori E.coli O₁₅₇ :H₇ decat inainte de intarcare [36].

Cu ocazia unui studiu in 28 de state diferite din SUA, privind peste o mie de efective de vaci de lapte si care a inclus examenul de probe de fecale provenind de la 7000 vitei neintarcati, E.coli O₁₅₇ :H₇ a putut fi izolata de la 25 de vitei din 19 turme. Intr-un studiu ulterior, Zhao si col. au putut arata ca 11 turme in prealabil negative pentru O₁₅₇ :H₇ au devenit pozitive pentru aceasta bacterie, si invers, 7 din efectivele pozitive au fost negative dupa 3 luni. Aceste rezultate sugereaza ca infectia efectivelor este trecatoare si ca ea necesita examenul a numeroase animale pe o perioada destul de lunga [15].

E.coli O₁₅₇ :H₇ la alte specii de animale 

La caprioare :

E.coli O₁₅₇ :H₇ a fost izolata de la caprioare, sugerand o posibila sursa a infectiei. Intr-un caz microorganismele izolate de la 2 caprioare si 5 vite intr-o ferma din Texas au avut origini identice la electoforeza.

Infectia a fost asociata cu consumul de carne de caprioara.

La porci :

O infectie cu E.coli O₁₅₇ :H₇ a relevat la porcii din Japonia acelasi nivel de infectie ca la vite si prezenta in efectivele de suine din U.S.A a fost recent demonstrata.

La caini :

Tulpina E.coli O₁₅₇ :H₇ a fost izolata de la doi caini proveniti de la o ferma din Washington. Au fost raportate cazuri si in Canada si U.K, printre care si prezenta serotipului O₁₅₇ :H₇ la cainele unui student veterinar.

La cai :

S-a raportat o infectie la un fermier cu O₁₅₇ dupa ce a ingrijit un cal bolnav, de la care s-a izolat aceeasi tulpina.

Lipsa semnelor clinice la vite face ca identificarea E.coli O₁₅₇ :H₇ sa fie destul de dificila. [23].

Este E.coli O₁₅₇:H₇ o zoonoza ?

Doua studii recente au demonstrat o rata a seropozitivitatii cu O₁₅₇ ridicata la familiile de fermieri. Exista rapoarte de toxicitate, totusi non infectioase cu E.coli O₁₅₇ identice printre familiile de fermieri in Ontario, unde au fost testate animalele si oamenii.

Au fost cateva incidente raportate de transmitere la copiii care au vizitat sau au locuit in ferme. In cateva dintre aceste cazuri, bacteria izolata de la copii si de la vaci s-a dovedit, a fi identica, prin electroforeza.

Transmiterea s-ar fi putut face prin laptele crud care s-a consumat la ferma.

In mai 2000 in Washington si noiembrie 2000 in Pennsylvania, 56 de copii au fost infectati (19 necesitand spitalizarea) prin contact cu animalele la scoala sau in timpul vizitei la ferme.

Aproximativ 26 de persoane in august 2001 s-au contaminat cu E.coli O₁₅₇ :H₇ vizitand targuri in Wisconsin in localitatea Ozaukee.

Cresterea riscului infectarii familiilor de fermieri cu E.coli O₁₅₇ :H₇ duce la posibilitatea ca indivizii din ferme cu expuneri repetate slabe sa dezvolte, de fapt, rezistenta la infectie [23].

Se presupune ca soarecii ar putea fi vectori de transmitere a E.coli O₁₅₇ :H₇, habitatul lor fiind in strans contact cu vitele si oile, iar organismul lor a demonstrat deja ca poate fi o gazda pentru bacterie [28].

6.2.2. Incidenta serotipului O₁₅₇:H₇ in produsele de origine animala

Tabel: 1.Frecventa VTEC in produsele animale

Tabel: 2 Frecventa E.coli O₁₅₇:H₇ in produsele animale

Desi E.coli O₁₅₇:H₇ a fost des izolata din carnea tocata ce a stat la originea principalelor epidemii, putine lucrari au verificat daca acest microb a contaminat alimentele prin intermediul carcaselor contaminate provenind de la animalele purtatoare. Chapman si col. au examinat probe de carne recoltate de la suprafata carcaselor de animale din abatorul Sheffield si au izolat E.coli O₁₅₇ :H₇ din 30,4% carcase ale animalelor din a caror fecale se izolase anterior aceasta bacterie. In acelasi timp s-a izolat E.coli O₁₅₇:H₇ la 8% din carcasele animalelor nepurtatoare dar taiate odata cu cele contaminate. S-ar putea da doua explicatii la aceste rezultate: fie ca are loc o contaminare incrucisata pe fluxul din abator, fie ca animalele considerate nepurtatoare excretau de fapt un numar mic de bacterii prin fecale, facand imposibila decelarea lor [15].

E.coli O₁₅₇:H₇ este o "forma mutanta" a E.coli gasindu-se in special in tractul intestinal al vitelor. Originea acestei bacterii nu a fost inca identificata. S-ar putea ca ea sa apara pe fondul unui stres in ferme, in timpul transportului in drum spre abator. Contaminarea carnii, in timpul taierii, se poate face dintr-o carcasa alaturata prin atingere sau atunci cand nu se lucreaza igienic. E posibil ca in timpul taierii carcasei, intestinele animalului sa fie intepate si continutul lor sa ia contact cu carnea taiata.

Toate acestea se intamplau, cu precadere, inainte de 1996 , an in care s-a implementat HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) [3, 38].

Prevenirea si controlul toxiinfectiilor alimentare

produse de O₁₅₇ :H₇ 

Metoda HACCP este in prezent recunoscuta ca unul dintre cele mai bune mijloace care pot asigura salubritatea alimentelor. Principiile acestei metode sunt recunoscute international si recomandate de Codex Alimentarius. Aplicarea acestei metode permite de altfel, o cale structurata si logica pentru a preveni si limita frecventa VETC in alimente. Cunoasterea conditiilor de crestere si supravietuire a VETC in alimente, ca si produse alimentare cel mai des incriminate in episoade cu O₁₅₇ :H₇, constituie o baza stiintifica care permite producatorilor de a determina usor punctele de risc si punctele critice (CCP) in lantul de fabricatie a produselor.

Tabel: 3. Potentiale surse de infectie ( H.Petridis)

Inafara respectarii stricte a regulilor de igiena generala si de aplicarea metodei HACCP, unele guverne, mai amenintate de toxiinfectiile alimentare cu O₁₅₇ :H₇ au luat masuri speciale. Aceste masuri vizeaza in esenta produsele crude cum este carnea si laptele [29].

Guvernul american a introdus necesitatea etichetarii carnurilor tocate crude de bovine. Etichetajul trebuie sa indice conditiile in care carnea trebuie sa se gateascǎ de consumator pentru a distruge VTEC eventuale prezente. Mai precis pe steaks hachés (hamburgar) se pot citi urmatoarele mentiuni : 'A se incalzi astfel ca temperatura in centrul produsului sa fie de 70sC timp de cel putin 2 minute sau a se astepta ca sucul carnii sa devina clar sa nu existe puncte rosii in interiorul humburgarului. Acesta este un control care se propune consumatorilor americani cat si responsabililor retelei de fast-fooduri pentru a asigura o buna preparare a carnurilor tocate [15].

Laptele crud si in general produsele lactate din lapte crud fac obiectul unei supravegheri inasprite in SUA si RU, deoarece aceste produse au fost citate de numeroase ori ca fiind la originea epidemiilor de E.coli O₁₅₇ :H_7. Astfel guvernul englez a incercat de doua ori, in ultimii ani, de a impune pasteurizarea laptelui de vaca si de a interzice comercializarea branzeturilor din lapte crud. Dar aceasta propunere s-a izbit de un refuz categoric al consumatorului englez care apreciaza, ca si consumatorul francez branzeturile din lapte crud. Totusi guvernul englez a introdus controale variate a acestor produse reusind sa limiteze consumul produselor din lapte crud. A introdus obligativitatea de a eticheta laptele crud de vaca in felul urmator: ' Acest lapte nu a fost tratat termic, el poate contine germeni periculosi pentru sanatatea omului'. Guvernul englez a luat aceste decizii ca urmare a argumentelor comunitatii stiintifice, care au fost urmatoarele :

epidemii cu E.coli O₁₅₇ :H₇ provocate de produsele lactate din lapte crud ;

boala este foarte grava ;

doza infectioasa este mica ;

laptele crud de vaca este deseori consumat de copii care sunt foarte sensibili la infectie ;

pasteurizarea este un mijloc eficace pentru a inactiva VTEC [15].

Astfel, fierberea suficienta a produselor alimentare crude inaintea consumarii lor pare a fi punctul critic numarul 1 in stapanirea riscurilor accidentelor alimentare cu E.coli O₁₅₇ :H₇. Insa trebuie avute in vedere si celelalte masuri preventive, si anume: respectarea stricta a igienei generale la abator dar si in toate sectoarele situate in aval si in toate filialele produselor alimentare (igiena localurilor, personalului, manipularilor: evitarea contaminarilor incrucisate [15].

Marler Clark a mai adaugat, pe langa acestea, cateva indicatii de prevenire si combatere a contaminarii cu STEC:

- Consumati numai suc si cidru pasteurizat.

Sucurile comerciale cu valabilitate mare care se vand la temperatura camerei trebuie pasteurizate, desi nu se indica acest lucru pe eticheta. Majoritatea sucurilor concentrate sunt, de asemenea, incalzite suficient pentru a inactiva microbii.

-Spalati fructele si legumele, in special cele care nu vor fi gatite.

-Consumati apa care a fost tratata cu clor sau alti dezinfectanti sau apa la sticla care a fost sterilizata.

-Evitati deglutirea apei de lac sau de piscina cand inotati, in special apa din piscinele publice.

-Asigurati-va ca persoanele cu diaree, in special copii, se spala pe maini cu sapun dupa ce au mers la baie pentru a reduce riscul raspandirii infectiei, la fel si persoanele care schimba scutece murdare.

Orice persoana cu diaree ar trebui sa evite inotul in piscine publice sau lacuri, sa utilizeze baia cu altii si sa gateasca pentru altii [18].

-Nu folositi niciodata aceleasi tacamuri: farfurii si cutite, linguri pentru carnea cruda si cea preparata.

-Dupa ce se racesc preparatele trebuie conservate la o temp. mai mica de 4,4sC [13].

Fig.19 : Surse de infectie 

Pentru depistarea efectivelor purtatoare de E.coli O₁₅₇:H₇  se recomanda examinarea probelor de fecale prin metode bacteriologice. Fermentarea grea a sorbitolului si aglutinarea latexului sunt teste de baza efectuate in majoritatea laboratoarelor. Un test serologic rapid pentru identificarea acestui microorganism la vite nu este disponibil. Este important de identificat cat de afectate sunt animale dintr-o turma diagnosticata pozitiv. Pentru a declara efectivul ca fiind pozitiv trebuie testat nu numar adecvat de animale. Pentru testarea unui singur animal si declararea testului negativ este suficienta examinarea a 3 probe, recoltate in zile diferite, de la un singur animal.

Pentru a proteja ferma de a deveni pozitiva cu O₁₅₇:H₇  trebuie intrerupta cumpararea viteilor de la efectivele de lapte identificate ca sursa de contaminare cu O₁₅₇:H₇  si incriminate ca fiind sursa unor imbolnaviri. Daca acel efectiv devine negativ la testari, trebuie limitata cumpararea viteilor. Chiar daca sursa exacta de E.coli O₁₅₇:H₇  nu se cunoaste, trebuie luate masuri pentru a preveni infectia cu alte bacterii patogene: verificarea provenientei animalelor inainte de a le cumpara, verificarea lor de paraziti sau alte insecte, curatenie si dezinfecteaza adapostul [30].

Consecintele diagnosticarii unei ferme ca pozitiva pentru E.coli O₁₅₇:H_7 :

In acest moment, nu exista o cerere de raportare a efectivelor pozitive cu O₁₅₇:H_7 . Daca efectivul a fost asociat cu cazuri umane de boala, autoritatile responsabile trebuie sa se implice si sa ceara cooperarea pentru testari. Se stie putin in prezent despre istoria E.coli O₁₅₇:H₇ in tractul gastro intestinal la bovine, si metodele de control dovedite nu pot fi specifice. Deci, procedura folosita pentru a controla infectia enterica, in general, poate fi incercata : izolarea animalelor identificate pozitive inainte ca retestarile sa indice ca sunt negative, hranirea viteilor cu colostru si hrana suplimentara pentru a controla agentii infectiosi care pot coloniza impreuna cu E.coli O₁₅₇:H₇ si optimizarea nutritiei. Se stie ca lipsa mancarii, care apare dupa intarcare, poate creste prezenta O₁₅₇:H₇  in fecale, ceea ce permite dezvoltarea altora in ferma, contaminarea laptelui si a carnii. Mentinand ferma intr-un program de supraveghere ajuta la mentinerea optimizarea managmentului fermei si evitarea pe viitor a proble- melor enterice.

Daca ferma a fost identificata ca fiind pozitiva cu E.coli O₁₅₇:H₇, nu trebuie sa se vinda, distribui sau consuma lapte nepasteurizat. Nu trebuie sa se vinda vitei la alta ferma testata negativ. Nu trebuie folosite fecalele vacilor ca ingrasa- mant in gradina pentru ca legumele se por infecta cu E.coli O₁₅₇:H₇  [30].

In 1998, Departamentul de Agricultura din U.S si microbiologii din cadrul Universitatii Cornell au descoperit ca o simpla schimbare in dieta vitelor inainte de taiere poate reduce riscul infectiei umane cu E.coli. Cercetatorii au raportat ca dieta vitelor bazata pe grane permite cresterea E.coli, cresterea aciditatii in stomacul oamenilor si cauzeaza boli intestinale.

Cercetatorii sustin ca exista o solutie pentru problema aceasta: hranind vitele cu cinci zile inainte de sacrificare cu fan, numarul E.coli rezistente poate scadea.

Majoritatea bacteriilor sunt distruse de sucul acid din stomac, dar E.coli produs al vitelor hranite cu grau, este rezistenta la acizi puternici. Cand oamenii consuma mancare contaminata cu E.coli rezistenta la acid, incluzand tulpina patogenica O₁₅₇:H₇, sansa de a se imbolnavi creste.

Hidrocarburile din fan nu sunt asa de usor fermentate, si fanul nu permite cresterea rezistentei aciditatii E.coli.

Studiile realizate la Cornell au aratat ca atunci cand sunt hranire cu ratie de grane vitele au 1 milion de E.coli pe gram de fecale, iar vitele hranite doar cu 60% cu grane de asemenea prezinta un numar mare de bacterii acido-rezistente, in comparatie cu vitele hranite doar cu fan sau iarba care au doar E.coli acid- sensibile, si aceste bacterii sunt distruse de un "soc-acid" mimat de stomacul uman [31].

Se pare ca iradierea alimentelor ar fi un mod bactericid pentru E.coli O₁₅₇:H₇ . Marile fast-fooduri isi bazeaza profitabilitatea si pe utilizarea materiei prime iradiate in scopul mentinerii prospetimii. Realizata corect iradierea nu afecteaza calitatile nutritive ale alimentelor. Insa multi dintre "abonatii" fast-food-urilor se plang ca mancarea din aceste restaurante nu astampara foamea. La fel se intampla cu alimentele iradiate din galantarele supermarketurilor: ele au un aspect ireprosabil, dar, in unele cazuri, sunt fade si nu sunt satioase [32].

Partea a-II-a

Cercetari personale

8. Material si metoda

8.1 Probe

Numarul ,modul de recoltare si trimitere a probelor la laboratoarele judetene 

In fiecare judet si Municipiul Bucuresti se recolteaza in fiecare luna, in vederea examinarii, cate 20 de probe carne de vita astfel:

a) .Din unitati de productie:

- 5 probe de carne din carcase sau piese

- 5 probe carne tocata

b)     Din unitati de desfacere:

5 probe carne din carcase sau piese

5 probe carne tocata.

Fiecare proba este reprezentata de o cantitate minima de 200g si se recolteaza aseptic in pungi de polietilena de unica utilizare. Cele din carcase sau piese se vor recolta de la suprafata acestora in felii de 5-7 mm grosime, iar cele de carne tocata din mai multe unitati de ambalaj sau tavi.

Probele recoltate se refrigereaza si se trimit in maxim 6 ore la Laboratorul care le va introduce imediat in lucru si numai in cazuri exceptionale, a doua zi, cu conditia pastrarii lor in conditii de refrigerare.

In prezenta lucrare au fost prelucrate la Institutului de Igiena si Sanatate Publica Veterinara un numar de 13 probe in perioada 2005-2006.

Aceste probe au fost suspicionate de laboratoarele judetene care le-au expediat, a fi contaminate cu E.coli O₁₅₇:H₇ .

8.2 Metoda de lucru

Metoda de lucru privind prezentarea practica, detaliata, de decelare a E.coli O₁₅₇ :H₇  din carne de vita, conform cu cea aprobata de ANSV nr.1617/24.05.1996.

8.3 Medii si reagenti 

Compozitia si modul de preparare a unor medii

de cultura speciale si reagenti 

Bulion E.C. modificat

Triptona (peptona)........20g

Saruri biliare No.3........1,12 g

Lactoza...........5g

Fosfat dipotasic..........4g

Fosfat monopotasic.......1,5g

Clorura de sodium.......5g

Apa distilata........ ...1000ml

pH final = 6,9 ± 0,2 la 25sC

Dupa dizolvarea ingredientelor se ajusteaza pH -ul si mediul se sterilizeaza prin autoclavare 20 minute la 110sC.

Pentru testarea probelor de carne cruda, la un litru de mediu preparat ca mai sus si racit la temperatura camerei, se adauga inainte de folosire:

-20 mg de novobiocina de sodiu ( 10 ml din solutia stoc) si

- 10 mg acriflavina hidroclorica ( 2 ml din solutia stoc)

Dupa adaugarea novobiocinei si acriflavinei, mediul care nu se foloseste imediat se poate pastra maxim o saptamana la 2-8sC.

Mediul complet are culoare rosietica- purpurie.

Prepararea solutiei stoc de novobiocina:

Novobiocina de sodium........0,03g

Apa distilata..............15ml.

Se sterilizeaza prin filtrare. Se adauga la bulionul racit imediat dupa preparare.

Agar Mac Conkey cu sorbitol

Peptona............20g

Sorbitol............10g

Saruri biliare..........1,5g

Clorura de sodiu........5g

Agar..............15g

Rosu neutru.........0,03g (3 ml din solutie 1%)

Cristal violet..........0,001g (0,01 ml din sol 1%)

Apa distilata...........1000ml

pH final....7,1±0,2- 25sC

Dupa dizolvarea ingredientelor, mai putin rosu neutru si cristalul violet, se verifica si eventual se corecteaza pH-ul. Se adauga si celelalte doua ingrediente, se repartizeaza in recipiente adecvate si se sterilizeaza prin autoclavare, 20 de minute la 110sC. Mediul are o culoare rosie -caramizie.

Coloniile bacteriilor sorbitol negative sunt incolore sau usor galbui, iar cele ale bacteriilor sorbitol pozitive sunt roz-rosietice.

Tehnica de izolare si identificare a bacteriei E.coli O₁₅₇ :H₇ 

Imbogatire

Se introduc 25g de carne bine maruntita prin tocare sau turmixare, in recipiente sau pungi de polietilena la prima folosire cu 225 ml de bulion E.C modificat, se omogenizeaza si se incubeaza 18-24 ore la 35sC.

Izolare

Din fiecare cultura obtinuta se fac urmatoarele dilutii in solutie tampon fosfat sau in ser fiziologic:10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7.

Din dilutiile 10^-5, 10^-6, 10^-7 se stiaza cate 0,1 ml pe suprafata agarului Mac Conkey cu sorbitol turnat in cutii Petri cu diametrul de 10 cm, folosind pipete Pasteur cu spatula Drigalski.

Incubare 18-24 ore la 42sC, preferabil sau la 35s-37sC.

Identificare 

Cinci colonii cu aspect caracteristic din fiecare proba, dezvoltate pe suprafata agarului Mac Conkey se insamanteaza fiecare in urmatoarele medii :

Reactie caracteristica pe mediile insamantate.

-Bulion nutritiv...........indol: pozitiva

-Bulion E.C in eprubete

cu tub de fermentatie.........fermentatie cu producere de gaze

-Apa peptonata cu sorbitol

si indicator...........sorbitol: negativa

-Apa peptonata cu celobioza

si indicator.........celobioza: negative

-Agar nutritiv inclinat......- reactia pt. beta-galactoza: negativa

- sero-aglutinarea cu ser anti O₁₅₇ pozitiva

-sero aglutinare cu ser anti H₇ pozitiva

-Agar TSI .............galben, galben,H₂S -negativa

-Agar cu lizina si fier........lizin-decarboxilaza: pozitiva

-Agar cu citrat (Simons)......citrat: negative

-Agar nutritive moale in coloana.....mobilitate: pozitiva

-Agar EMB (Levin, GEAM)......colonii caracteristice pt E.coli

Incubare 18-24 ore la 35sC.

8.5 Interpretarea rezultatelor

Executarea reactiei beta-galactoxidazei cu cultura dezvoltata pe agarul inclinat.

Executarea reactiei de sero-aglutinare rapida pe lama folosind cultura de pe agarul inclinat si serurile anti O₁₅₇ si H₇.

Stimularea mobilitatii prin insamantari pe suprafata agarului moale turnat in cutii Petri cu diametrul mic (6-8cm) la culturile care nu au aglutinat cu serul anti H₇ si repetarea sero-aglutinarii cu cultura stimulata.

9. Metoda propusǎ 

In 2004 a fost propusa urmatoarea metoda, de catre Autoritatea Nationala Sanitara Veterinara si pentru Siguranta Alimentelor, Institutului de Igiena si Sanatate Publica Veterinara, conform standardului roman aprobat de Directorul General al ASRO identic cu standardul european EN ISO 16654 :2001.

La inceputul documentului se face o atentionare asupra faptului ca E.coli O₁₅₇ :H₇ poate cauza imbolnaviri severe iar doza infectiilor este scazuta. Au fost semnalate infectii produse in laborator.

Pentru a proteja sanatatea personalului din laborator, este esential ca aceasta metoda sa fie efectuata in intregime de personal instruit care foloseste GPL si lucreaza de preferat in spatii izolate .Trebuie adoptate legi nationale privind sanatatea si securitatea referitoare la acest microorganism.

Domeniul de aplicare 

Acest standard international stabileste metoda orizontala pentru detectarea Escherichiei coli serogrupul O_157. Acest standard international se aplica produselor destinate consumului uman sau furajarii animalelor.

9.2.Termen si definitie 

Pentru scopurile acestui standard international se aplica urmatorul termen si definitie.

Escherichia coli O157

E.coli O 157

Microorganism care formeaz colonii tipice pe suprafata mediului de insaman- tare folosit in acest standard international si care produce indol si aglutinare specifica cu antiserul antigenului O157.

Nota1- Tulpinile de E.coli O₁₅₇ :H₇  sorbitol pozitive nu sunt detectate pe mediul CT-SMAC

Nota2- Pot apare unele mutatii indol-negative

9. 3.Principiu 

Detectarea E.coli O₁₅₇ necesita patru etape succesive :

a)     Imbogatirea probei omogenizate in mediu de extract de soia triptonat modificat care contine novobiocina (mTSB + N) prin incubare la 41,5 sC ± 1sC timp de 6 h si apoi din nou de la 12 h la 18 h.

b)    Separarea si concentrarea microorganismelor cu ajutorul particulelor imunomagnetice grefate cu anticorpi E.coli O₁₅₇

c)     Izolarea prin cultivarea particulelor imunomagnetice cu bacterii care adera la agar Mac Conkey cu cefixim-telurit-sorbitol (CT-SMAC) si, la alegerea utilizatorului , la un al doilea mediu de izolare selective pe baza de agar.

d)    Confirmarea coloniilor sorbitol-negative de pe CT-SMAC si a coloniilor tipice de E.coli O₁₅₇ pe al doilea agarde izolare, prin producerea indolului si aglutinarea cu antiserul E.coli O₁₅₇ .

Nota- Caracterizarea ulterioara, de exemplu cu marcatori patogeni, a izolatelor pozitive, se poate face prin trimiterea acestora la un laborator de referinta corespunzator.

9. 4. Mediul de cultura, reactivi si antiser 

9.4.1 Mediul de imbogatire : extract de soia triptonat modificat cu novobiocina (mTSB+ N)

9.4.1.1. Exract de soia triptonat modificat (mTSB)

a) Compozitie :

Digest enzimatic de cazeina ..........17,0 g

Digest enzimatic de soia...........3,0g

D(+)-glucoza..............2,5g

Saruri biliare nr.3..............1,5g

Clorura de sodiu...............5,0g

Fosfat dipotasic (K₂HPO₄).........4,0g

Apa...................1000ml

b)Preparare:

Se dizolva componentele sau mediul complet deshidratat de apa, incalzind daca este necesar. Se ajusteaza pH -ul, folosind pH metrul (5.6), daca este necesar, in asa fel incat dupa sterilizare sa fie 7,4± 0,2 la 25sC.

Se repartizeaza mediul in cantitati corespunzatoare in flacoane sau sticle (5.7)

Se sterilizeaza 15 min in autoclava (5.1) adusa la 121sC.

9.4.1.2. Solutia de novobiocina

a)    Compozitie :

Novobiocina..............0,45g

Apa................100ml

b) Preparare

Se dizolva novobiocina in apa si se sterilizeaza prin filtrare prin membrana.

Se prepara in ziua utilizarii.

9.4.1.3. Prepararea mediului complet

Chiar inainte de utilizare, se adauga 1 ml sau 4 ml de solutie de novobiocina la 225 ml sau respectiv 900ml de mTSB racit.

Concentratia finala de novobiocina este de 20mg pe litru de mTSB.

9.4.2 Primul mediu selectiv de izolare : Agar Mac Conkey cu cefixim-telurit-sorbitol (CT-SMAC)

4.2.1 Mediu de baza

a)Compozitie:

Digest enzimatic de cazeina..........17,0 g

Digest enzimatic de tesuturi animale3,0g

Sorbitol.................10,0 g

Saruri de bila nr.3.............1,5g

Clorura de sodiu.............5,0g

Rosu neutru.................0,03g

Cristal violet................0,001g

Agar...............intre 9g si 18 g^a

Apa..................1000ml

^a=depinde de puterea de gelifiere a agarului

b)    Preparare :

Se dizolva componentele de baza sau baza deshidratata complet in apa la fierbere. Se ajusteaza pH-ul, daca este necesar, in asa fel incat dupa sterilizare sa fie 7,1±0,2 la 25sC.

Se sterilizeaza 15 min in autoclava adusa la 121sC.

9. 4.2.2.Solutie telurit de potasiu

a)Compozitie :

Telurit de potasiu pentru utilizare bacteriologica ...0,25g

Apa....................100ml

b)Preparare :

Se dizolva teluritul de potasiu in apa si se sterilizeaza prin filtrare prin membrana.

Aceasta solutie se poate pastra la temperatura camerei pana la 1 luna, dar se arunca daca se formeaza precipitat alb.

9.4.2.3 Solutie de cefixima

a)    Compozitie :

Cefixima.................5,0 mg

Apa................100,0ml

b)    Preparare :

Se dizolva cefixima in apa si se sterilizeaza prin filtrare prin membrana

Nota- Poate fi necesar ca cefixima sa fie dizolvata in etanol

Aceasta solutie se poate pastra la 3sC ±2sC timp de o saptamana.

9.4.2.4 Mediul complet

a)    Compozitie :

Mediul de baza (4.2.1)............1000ml

Solutie de telurit de potasiu(4.2.2)......1,0ml

Solutie de cefixima(4.2.3)..........1,0 ml

b) Preparare :

Se raceste mediul de baza proaspat sterilizat intre 44sC si 47sC, sau se topeste mediul de baza sterilizat si solidificat inainte, prin incalzire pe baia de aburi, apoi se raceste intre 44sC si 47sC.

Se adauga 1 ml solutie de telurit si 1 ml solutie de cefixima la 1000ml de mediu de baza. Se amesteca si se toarna in parti de circa 15 ml in cutii Petri sterile (5.15). Se lasa sa se solidifice.

Concentratia finala de telurit este de 2,5 mg/l si de cefixima de 0,05 mg/l.

Chiar inainte de folosire, se usuca placile de agar, de preferinta fara capace si cu suprafata agarului in jos, intr-o etuva adusa la temperatura cuprinsa intre 25sC si 50sC, pana cand dispar picaturile de pe suprafata mediului. Nu se usuca in continuare. Placile de agar pot fi uscate de asemenea intr-o nisa cu flux laminar, timp de 30 min cu capacele deschise pe jumatate, sau peste noapte cu capacele puse.

Daca se prepara din timp, placile neuscate se pot depozita la intuneric in pungi de material plastic sau alte containare care pastreaza umiditatea, in frigider la 3sC ±2sC timp de pana la 2 saptamani.

Al doilea mediu selectiv de izolare

Se foloseste orice alt mediu selectiv de izolare, la alegerea laborantului, complementar cu mediul de agar CT-SMAC si corespunzator in special pentru izolarea Escherichiei coli O157.

Chiar inainte de folosire, se usuca placile cu agar, de preferinta fara capace si cu suprafata agarului in jos, intr-o etuva adusa la temperatura cuprinsa intre 25sC si 50sC, pana cand dispar picaturile de pe suprafata mediului. Nu se usuca in continoare. Placile de agar pot fi uscate de asemenea inrt-o nisa cu flux laminar, timp de 30 min cu capacele deschise pe jumatate, sau peste noapte cu capacele puse.

Daca se prepara din timp, placile neuscate se pot depozita la intuneric in pungi de material plastic sau alte containare care pastreaza umiditatea, in frigider la 3sC ±2sC timp de pana la 2 saptamani.

Agar nutritiv

a)Compozitie :

Extract de carne.............3,0g

Peptona................5,0g

Agar...........intre 9g si 18g^a

Apa...............1000ml

^a depinde de puterea de gelifiere a agarului

b)Preparare :

Se dizolva componentele sau mediul complet deshidratat in apa, incalzind, daca este necesar. Se ajusteaza pH, daca este necesar, in asa fel incat dupa sterilizare sa fie 7,0± 0,2 la 25sC.

Se transfera mediul in flacoane sau sticle (5.7) de capacitate corespunzatoare.

Se sterilizeaza 15 min in autoclava (5.1) adusa la 121sC.

c) Prepararea placilor de agar nutritiv

Se transfera circa 15 ml din mediul topit racit, intre 44sC si 47sC in cutii Petri si se lasa sa se solidifice.

Chiar inainte de folosire, se usuca placile cu agar, de preferinta fara capace si cu suprafata agarului in jos, intr-o etuva adusa la temperatura cuprinsa intre 25sC si 50sC, pana cand dispar picaturile de pe suprafata mediului. Nu se usuca in continoare. Placile de agar pot fi uscate de asemenea inrt-o nisa cu flux laminar, timp de 30 min cu capacele deschise pe jumatate, sau peste noapte cu capacele puse.

Daca se prepara din timp, placile neuscate se pot depozita la intuneric in pungi de material plastic sau alte containare care pastreaza umiditatea, in frigider la 3sC ±2sC timp de pana la 2 saptamani.

Mediul Triptona/triptofan

a)    Compozitie :

Triptona..................10,0g

Clorura de sodiu..............5,0g

DL-triptofan.................1,0g

Apa...................1000ml

b)    Preparare :

Se dizolva componentele in apa la fiebere, daca este necesr. Se ajusteaza pH, in asa fel incat dupa sterilizare sa fie 7,5± 0,2 la 25sC.

Se repartizeaza in cantitati de 5 ml in eprubete sau sticle de capacitate corespunzatoare.

Se sterilizeaza 15 min in autoclav adus la 121sC.

Reactivul Kovac pentru indol

a)    Compozitie :

4-dimetilaminobenzaldehida........5,0g

2-metilbutanol sau 1-pentanol..........75,5ml

Acid clohidric (ρ₂₀ intre 1,18 g/ml si 1,19g/ml)..25,0ml

b)    Preparare :

Se dizolva 4-dimetilaminobenzaldehida in alcool, incalzind daca este necesar pe o baie de apa mentinuta intre 44sC si 47sC. Se raceste la temperatura camerei si se adauga acidul clorhidric.

Se protejeaza de lumina intr-o sticla maro si se depoziteaza la 3sC ±2sC.

Reactivul trebuie sa fie galben deschis spre maro deschis si fara precipitat.

9.4.7 Particole imunomagnetice anti Escherichia coli O157

Exista particole imunomagnetice grefate cu anticorpi specifici E.coli O₁₅₇, pentru concentrarea si separarea acestor microorganisme.

Nota- sunt disponibile din surse comerciale. Instructiunile producatorului referitoare la preparare si folosire trebuiesc respectate riguros.

9.4.8 Tampon pt. spalare: tampon de fosfat modificat, 0,01 mol/l cu pH 7,2

a)Compozitie

Clorura de sodiu...............8,0g

Clorura de potasiu............0,2g

Fosfat disodic (anhidru)...........1,44g

Fosfat monopotasic(anhidru).........0,24g

Polioxietilen sorbitan monolaura

( Tween 20 sirop).............0,2ml

Apa.................1000ml

c)     Preparare:

Se dizolva componentele in apa. Se ajusteaza pH-ul , daca este necesar, la 7,2± 0,2 la 25sC.

Se repartizeaza in sticle sau flacoane de volum corespunzator pentru folosire.

Se sterilizeaza 15 min in autoclav adus la 121sC. Solutia poate sa apara tulbure, dar se limpezeste daca sta.

Se poate folosi tampon de fosfat disponibil comercial cu aceeasi compozitie si aceleasi performante.

9.4.9 Solutie salina normala

a) Compozitie :

Clorura de sodiu..............8,5g

Apa................ 1000ml

c)     Preparare :

Se dizolva clorura de sodiu in apa. Se repartizeaza in sticle sau falcoane de volum corespunzator pentru folosire.

Se sterilizeaza 15 min in autoclav adus la 121sC.

9.4.10 Antiser Escherichia coli O157, disponibil din laboratoare specializate sau din surse comerciale ca separat somatic 'O' 157.

Antiserul trebuie verificat prin teste pozitive si negative inainte de utilizare pe izolate necunoscute.

9.5. Aparatura si sticlarie 

Aparatura uzuala microbiologica:

5.1 Aparatura pentru sterilizare uscata (etuva) si/sau sterilizare umeda (autoclav)

5.2 Etuva sau incubator, apta de a fi mentinuta intre 25sC si 50sC.

5.3 Incubator, apt de a fi mentinut la 37sC ±1sC

5.4 Incubator, apt de a fi mentinut la 41,5sC±1sC.

5.5 Baie de apa apta de a fi mentinuta intre 44sC si 47sC.

5.6 pH-metru, apt de a citi 0,01 unitati de pH la 25sC, capabil de a face masurari cu o exactitate de ±0,1 unitati pH

5.7 Eprubete, flacoane sau sticle de capacitate corespunzatoare, pentru sterilizare si depozitarea mediilor de cultura si incubarea mediilor lichide.

5.8 Cilindri de masurare, de capacitate corespunzatoare, pentru prepararea dilutiilor si mediilor complete.

5.9 Pipete gradate, cu capacitate nominala de 1 ml si 10 ml, gradate in diviziuni de 0,1 ml si respectiv 0,5 ml.

5.10 Anse, facute din platina/iridiu sau nichel/crom sau pipete Pasteur sau anse de unica utilizare.

5.11 Pipete mecanice, sterile, cu un domeniu de operare de la 20μl la 200μl cu diviziuni de 10 μl sau similare.

5.12 Separator magnetic cu support magnetic, pentru concentrarea particulelor imunomagnetice, pentru folosire cu eprubete de plastic tip Eppendorf

5.13 Eprubete tip Eppendorf de material plastic, cu capac insurubat, sterile, de unica folosinta, tip centrifuga, cu capacitate de 1,5 ml care se potrivesc in suportul magnetic.

A se evita formarea de aerosoli la deschidere.

5.14 Mixer rotativ (tip moara de vant, mixter pentru probe de sange), apt pentru rotatii de 15r/min la 20r/min.

5.15 Cutii Petri , cu diametre de 90 mm si 140 mm

5.16 Mixter Vortex

9.6 Esantionare

Este important ca laborantul sa primeasca o monstra care sa fie pe intreg reprezentativa si sa nu fie alterata sau schimbata in timpul transportului si depozitarii.

Se recomanda racirea rapida a probei inainte de depozitare.

9.7 Metoda de lucru 

9.7.1 Proba si suspensie initiala

In general, pentru a prepara suspensia initiala, se adauga o proba de x g sau x ml sau 9x ml sau 9x g mediu extract de soia triptonat modificat cu novobiocina (mTSB + N), preincalzit in incubator la 41,5sC pentru a obtine un raport proba la mTSB+N de 1/10 (masa la volum sau volum la volum).

Este recomandabil ca proba sa se puna in pungi cu plasa pentru a reduce interferenta particulelor alimentare cu kiturile de imunocaptura.(7.3)

Imbogatire

Se incubeaza suspensia initiala, preparata conform 7.1 la 41,5 sC , timp de 6 h si apoi din nou de la 12h pana la 18h (adica un timp total de la 18h la 24 de h).

O incubare de 6h urmata de o separare imunomagnetica si insamantare pe agar selectiv poate conduce la un rezultat presupus pozitiv care poate deveni negativ dupa o incubare de inca 18h.

Separare imunomagnetica (IMS)

a)    Generalitati :

IMS trebuie efectuata dupa 6h din nou , daca este necesar, dupa o incubatie de 12h pana la 18h.

b) Imunocaptura :

Atentie- Se vor folosi tehnici aseptice pentru a preveni orice contaminare externa si formarea aerosolilor. Aceasta operatie se efectueaza in boxe sau nise, daca exista. Se lucreaza cu manusi de protectie.

Se foloseste urmatoarea procedura de captare/separare prin folosirea separatorului magnetic (5.12) si a particulelor imunomagnetice cu anticorpi grefati(4.7)

Se amesteca cultura imbogatita (7.2) si se lasa sa se depuna particule mari de aliment. Intr-o eprubeta tip Eppendorf de material plastic se adauga 20 l de particule pregatite imunomagnetic ( 4.7) la temperature camerei. Se ia 1ml din stratul superior al cuturii imbogatite, evitand daca este posibil transferul particulelor de aliment sau a materiilor grase si se transfera in eprubeta tip Eppendorf din plastic.

Se amesteca suspensia intr-un mixer rotativ reglat intre 12r/min si 20r/min timp de 10 min.

c) Separare

Se pune fiecare eprubeta tip Eppendorf de material plastic in suportul magnetic si se lasa sa se aglomereze particulele magnetice pe magnet prin rotire usoara a suportului cu 180s. Se deschide cu grija capacul fara a deranja particulele de pe peretii eprubetei. Folosind o noua pipeta sterila Pasteur pentru fiecare proba si cu eprubeta aflata in suportul magnetic, se indeparteaza lichidul prin absorbtia inceata din fubdul eprubetei. Se adauga 1ml tampon steril pentru clatire (4.8) si se pune dopul. Se scoate magnetul din suport. Se amesteca continutul eprubetei prin rotire inceata a suportului cu 180sC si apoi se repune magnetul in suport.

Se va preveni contaminarea incrucisata la adaugarea tamponului proaspat.

Se repeta procedura de indepartare a lichidului de spalare cu o noua pipeta Pasteur sterila pentru fiecare proba. Se repeta procedura de spalare de mai multe ori.

Se scoate din separatorul magnetic si se adauga 100μl tampon de spalare steril in eprubeta si se suspenda particulele magnetice.

9.7.4 Insamantarea pe agaruri selective si identificarea coloniilor de E.coli O_157.

a) Insamantare 

Prin folosirea unei pipete mecanice, se transfera 50μl din suspensia de particole magnetice spalate (7.3.c) pe o placa uscata de agar-cefixima-telurit-sorbitol Mac Conkey si de asemenea 50μl pe o placa pre-uscata din cel de al doilea mediu de izolare (4.3).

Se imprastie particulele pe o ansa sterila pentru a obtine multe colonii distincte pe agar.

Se incubeaza CT-SMAT la 37sC de la 18h pana la 24h si se incubeaza cel de al doilea agar selectiv la temperatura si timpul recomandat.

In functie de tipul probei alimentare si flora sa microbiana, incubarea pe mediul imbogatit de la 20h pana la 24h poate cauza crestere intensa a altor bacterii pe placile cu agar selectiv asa incat coloniile de E.coli O₁₅₇ sunt dificil de gasit. Inocularea agarurilor selective cu dilutii ale preparatelor IMS sau volume mai mici de 50μl per placa poate creste posibilitatea de a obtine colonii separate de E.coli O₁₅₇ dar este de remarcat ca aceasta poate ridica totodata si limita de electie.

b)    Recunoasterea coloniilor tipice de E.coli O₁₅₇

Pe agarul CT-SMAC coloniile tipice sunt transparente si aproape incolore, cu aspect galben-brun deschis si cu un diametru de aproximativ 1mm.

Se examineaza cel de al doilea agar selectiv pentru colonii tipice de E.coli O₁₅₇ urmarind instructiunile producatorului.

9.7.5 Confirmare

Nota- Se pot folosi kituri biochimice de identificare disponibile comercial care permit identificarea E.coli sorbitol-negativa si indol-pozitiva si aglutinare latex, cu conditia ca acesta sa fie testate cu tulpini cunoscute ca pozitive si negative pentru a confirma performanta.

a)    Selectarea coloniilor

Se iau cinci colonii tipice de pe fiecare placa, cum s-a aratat la 7.4. Daca o placa de agar contine mai putin de 5 colonii tipice, toate coloniile trebuie examinate.

Se trece fiecare colonie selectata pe o placa cu agar nutritiv si se lasa sa se dezvolte colonii distincte.

Se incubeaza placi la 37sC timp de 18h pana la 24h.

Se folosesc numai culturi pure de pe placile de agar nutritiv pentru testarile descrise la b) si c).

b)    Confirmarea biochimica :formarea indolului

Se inoculeaza o colonie din cultura pura pe agar nutritiv intr-o eprubeta cu mediu triptona/triptofan (4.5)

Se incubeaza la 37sC timp de 24h.

Se adauga 1ml reactiv Kovac (4.6) si se lasa la temperatura camerei timp de 10 min.

Aparitia unei culori rosii indica o reactie pozitiva. O culoare galben /brun indica o reactie negativa.

c)     Identificare serologica 

Generalitati : Se examineaza numai coloniile indol-pozitive pentru reactia serologica cu antiserul E.coli O₁₅₇ .

Eliminarea izolatelor care se autoglutineaza.

Se pune o picatura de solutie salina (4.9) pe o lamela de sticla curata.

Folosind o ansa, se amesteca in aceasta picatura o colonie de pe mediul nutritiv de agar in asa fel incat sa se obtina o suspensie omogena si turbulenta.

Se vibreaza usor lamela de la 30s pana la 60s. Se urmareste rezultatul pe fond intunecat si, daca este necesar, cu lentile de marire.

Daca suspensia a format cheaguri vizibile, tulpina se considera ca se autoaglutineaza si nu trebuie testata mai departe, reactia cu antiserul specific nefiind posibila.

Reactia cu antiserul E.coli O₁₅₇ .

Folosind o colonie pura de pe agarul nutritiv, se disperseaza aceasta intr-o picatura de solutie salina si se adauga o mica picatura de antiser E.coli O₁₅₇ (4.10)

Daca apare aglutinare intr-un minut, reactia este pozitiva.

Identificarea pozitiva

Se considera izolate pozitive acelea care sunt indol-pozitive si reactioneaza fie cu antiserul E.coli O₁₅₇ fie cu antiserurile O₁₅₇ plus H₇, daca sunt disponibile.

9.7.6 Caracterizare ulterioara

Pentru caracterizarea ulterioara a coloniilor pozitive la detectarea antigenelor flagelare si pentru caracterizarea patogena, culturile se trimit la laboratoare de referinta.

9. 8. Asigurarea calitatii

a) Tulpini test pentru scopuri de asigurare a calitatii 

Din colectii de culturi nationale si internationale sunt disponibile tulpini de E.coli O₁₅₇ care nu prezinta factori de virulenta atribuite patogenitatii. Acestea sunt recomandate pentru testarea mediilor si antiserurilor din punct de vedere al asigurarii calitatii.

c)     Metoda culturii

Pentru a verifica abilitatea laboratorului si a mediilor pentru detectarea unui continut mic de Escherichia coli O₁₅₇ in probele alimentare prin teste cu metoda descrisa, trebuie lucrate in paralel cu proba probe de referinta din inocul slab de E.coli O₁₅₇ nepatogen si dintr-un inocul bogat al altei tulpini de E.coli.

9.9 Exprimare rezultate

Conform interpretarii rezultatelor, se raporteaza prezenta sau absenta Escheri- chiei coli O₁₅₇ in proba, specificand masa in grame sau volumul de mililitri a probei testate.

9.10. Buletin de analiza

Buletinul de analiza trebuie sa contina urmatoarele:

toate informatiile necesare pentru identificarea completa a probei

metoda de esantionare folosita, daca se cunoaste

metoda de testare utilizata, cu referire la acest standard international

temperatura de incubare

orice detalii de operare nespecificate in acest standard international sau considerate operationale, impreuna cu detalii asupra oricarui incident care poate afecta rezultatul

rezultatele obtinute

Buletinul de analiza trebuie sa mentioneze daca urmeaza sa se faca determinari ulterioare la un laborator de referinta sau, o data efectuate, rezultatele obtinute raman aceleasi.

10. Rezultate si discutii

10.1 Interpretarea metodei de lucru 

♦ Raspunsul caracteristic la testele biochimice si sero-aglutinare pozitiva la ambele seruri → Escherichia coli O₁₅₇ si H₇ este prezenta in 25 g de produs.

♦ In caz ca toate testele sunt caracteristice, dar aglutinarea cu serul anti H₇ este negativa → Escherichia coli O₁₅₇ si H₇ imobila, absenta in 25 g produs

♦ Raspuns negative la testele biochimice si sero-aglutinare→ Escherichia coli O₁₅₇ si H₇ absenta in 25g de produs.

Fig.20:Imbogatirea selectiva cu bulion E.C

Fig.21:Izolarea pe suprafata agarului Mac Conkey cu sorbitol.

Fig.22:E.coli- colonii sorbitol pozitive -mediu Mac Conkey

Fig.23:E.coli O₁₅₇:H₇ -colonii sorbitol negative- mediul Mac Conkey

Fig.24: E.coli O₁₅₇:H₇ -colonii transparente si mult mai mici decat cele ale E.coli.

Fig.25:E.coli- colonii mari, rosii rubinii.

Fig.26: Culturi in bulion si agar inclina.

Fig.27:Cultura de E.coli O₁₅₇:H₇ pe agar inclinat.

Fig.28:Cultura in bulion nutritiv- reactie indol pozitiva.

Fig.29:Fermentatie cu producere de gaze in bulionul E.C. aflat in eprubete cu tub de fermentatie- Durham.

Fig.33: Colonii de E.coli O₁₅₇:H₇ pe mediul Levin.

Fig.36: Examinarea propietatilor glucidolitice in apa peptonata cu albastru de bromtimol sau rosu fenol.

Fig.37:Seroaglutinare pozitiva.

Conform metodei de lucru aprobata de ANSV nr.1617/24.05.1996 s-au obtinut urmatoarele rezultate in perioada 2005-2006 la Institutul de Igiena si Sanatate Publica Veterinara.

Tabel : 4. Rezultate obtinute in anul 2005

Tabel : 5. Rezultate obtinute in anul 2006 

Intre 1 ianuarie 2005 si sfarsitul lui 2006 au fost identificate 3 tulpini de E.coli O₁₅₇ : H₇ in alimente dintr-un total de 13 probe pozitive pentru E.coli analizate, de mentionat ca toate rezultatele pozitive s-au inregistrat in anul 2005 in urmatoarele localitati :Alexandria -judetul Teleorman, Iasi si Slatina-judetul Olt.

Aceasta arata ca serotipul O₁₅₇: H₇ se gaseste si in tara noastra, dar are o incidenta scazuta.

Din cele 13 probe analizate: 9 au fost probe de carne de vita (din care o proba pozitiva), 3 de carne tocata de vita (din care o proba pozitiva) si a mai fost o proba de hamburger de vita identificata pozitiva.

Fig.38: Probe supuse studiului.

Din cele 13 probe analizate: 6 (46,15%) au fost confirmate biochimic si 3 (23,07%) confirmate serologic.

In anul 2005, din cele 6 probe suspicionate de contaminare cu Escherichia coli O₁₅₇:H₇, au fost confirmate biochimic 3, care s-au confirmat si serologic.

In anul 2006, din cele 7 probe suspecte, au fost confirmate biochimic 3 iar serologic niciuna.

Fig.39: Probe confirmate biochimic din totalul celor

13 probe suspicionate ca fiind pozitive cu serotipul O₁₅₇: H_7.

Fig.40: Probe confirmate serologic din totalul celor

13 probe suspicionateca fiind pozitive serotipul O₁₅₇: H_7.

10.2 Distributia probelor analizate pe judete (Fig.41)

10.3 Masuri privind produsul contaminat 

Loturile de carne la care s-a detectat Escherichia coli O₁₅₇ si H₇ sau O₁₅₇ imobil nu se admit in consum public ca atare. Ele se vor dirija pentru prelucrare in produse care in procesul de prelucrare se supun unor tratamente termice de minimum 75sC timp de 15 minute.

10.4 Masuri privind unitatile producatoare 

Unitatile producatoare la care s-a constatat probe pozitive se vor supune controlului intensiv o saptamana, timp in care:

Unitatile vor inaspri conditiile de igiena, iar Inspectia sanitara veterinara nu va accepta inceperea lucrului, daca constata deficiente in aplicarea si eficienta operatiunilor de igienizare.

Inspectia veterinara va mari frecventa de recoltare a probelor pentru examenul de laborator: se vor recolta probe in fiecare zi si schimb de tura. In functie de rezultatul examenului de laborator se vor lua urmatoarele masuri:

daca nu se constata nici o proba pozitiva, unitatea va reintra in programul normal de supraveghere.

daca in perioada de control intensiv se constata una sau mai multe probe pozitive, unitatea se va inchide pe o durata de 2 saptamani, timp in care se vor aplica cel putin doua operatiuni complete de igienizarela intervale de o saptamana si se va cauta sa se indentifice provenienta animalelor a caror carne a fost contaminata cu Escherichia coli O₁₅₇ si H₇, dupa care unitatea isi poate relua activitatea.

Timp de o saptamana de la reluarea activitatii, unitatea va fi mentinuta in control intensiv. Daca in aceasta perioada nu se detecteaza nici o proba pozitiva, unitatea reintra in programul normal de supraveghere: daca se constata una sau mai multe probe pozitive, unitatea se inchide pe timp nelimitat.

10.5 Concluzii 

Investigatiile intreprinse in cadrul acestui studiu ne permit sa extragem urmatoarele concluzii:

1.Imbolnavirile produse de E.coli O₁₅₇:H₇ sunt de o gravitate foarte mare, fiind incadrate in grupa toxiinfectiilor alimentare.

2.Vacile de lapte, dupa cunostintele actuale, reprezinta principalul rezervor pentru E.coli O₁₅₇:H₇, ca si produsele si subprodusele provenite de la aceste animale.

3.In cadrul I.I.S.P.V Bucuresti au fost prelucrate 13 probe suspicionate a fi contaminate cu E.coli O₁₅₇:H₇

4.In urma investigatiilor ample efectuate din cele 13 probe, au fost confirmate biochimic 6.

5.Din cele 6 probe confirmate biochimic, numai 3 au fost confirmate serologic.

6.In anul 2005, din cele 6 probe suspicionate de contaminare cu E.coli O₁₅₇:H_7, au fost confirmate biochimic 3, care s-au confirmat si serologic.

7.In anul 2006, din cele 7 probe suspecte, au fost confirmate biochimic 3, iar serologic niciuna.

8.Acest studiu demonstreaza ca in anul 2005 s-a identificat serotipul O₁₅₇:H₇ de E.coli, la carnea de vita, pe teritoriul Romaniei in judetele Olt, Teleorman si Iasi.

BIBLIOGRAFIE

1.www.people.ku.edu -John C.Brown What the Heck is an E.coli?

2.Dobre Barzoi, Sergiu Meica, Marian Negut -Toxiinfectii alimentare

3.www.ericsecho.org -Eric's Echo-What is E.coli O₁₅₇:H₇.What Can Be Done About It?.

4.Mihai Decun- Infectii colibacilare la animale, 1986, Ed.Ceres, Bucuresti.

5.www.infektionsforschung.uni-wűerzburg.de/ ecoli 2007 html.

6.www.aphis.usda.gov- Riley L.W, Remis R.S, Helgerson S.D, et al. - Hemorrhagic colitis associated with a rare Escheririchia coli serotype,1983, New England , J. of Medicine

7.I.Togoe, Mimi Dobrea -Microbiologie veterinara, 2006, Ed. Printech, Bucuresti.

8.Simona Ivana -Tratat de bacteriologie medical-veterinara si introducere in micologie, 2006, Ed.Stiintelor Medicale , Bucuresti.

9.www.univ-rouen.fr- Caractéristiques générales d'E. coli.

-Pouvoir pathogène du sérotype O₁₅₇:H₇ d'E.coli.

10.Dobre Barzoi si Sorin Apostu- Microbiologia produselor alimentare,

11.www.nurseminerva.co.uk- Vernozy Rozand- Verotoxin- producing Escherichia coli (VTEC) and Escherichia coli O₁₅₇:H₇ in medicine and food industry.

12.https://en.wikipedia.org- How is E.coli O₁₅₇:H₇ spread?,Updated December6, 2006.

13.www.eatwelleatsafe.ca- Escherichia coli O₁₅₇:H₇ : les symptoms, personnes à risque.

14.www.amnh.com- How E.coli O₁₅₇:H₇ Poisons The Body.

15.https://www.isz.it- Vernozy-Rozand C, S.Ray-Gurniot- Escherichia coli O₁₅₇. Etude clinique, pathogénitique, épidemiologique et prevention des accidents alimentaires.

www.academic.evergreen.edu- The Escherichia coli O₁₅₇:H₇ Phage Project, 24 April, 2003

17.https://intoxaliment.iquebec.com-Intoxication par Escherichia coli O₁₅₇:H₇ , La maladie du Hamburger- Structure des protéines et de la toxine.

18.www.about-ecoli.com- Marler Clark-About E.coli O₁₅₇:H_7.

19.www.sfatulmedicului.ro

20.www.medicalnewstoday.com- Bioniche E.coli O₁₅₇:H₇ Cattle Vaccine Authorized For Field Use In Canada.

21.https://www.ncbi.nlm.nih.gov- Su C, Braudt LJ- Escherichia coli infection in humans,

22.https://www.pubmedcentral.nih.gov - Abdul Raoufet col- Survival and growth of Escherichia coli O₁₅₇:H₇ on salad vegetable.

23.www.vetmed.wisc.edu- E.coli O₁₅₇:H₇ :Backgrouand and disease in humans.

24.www.fsis.usda.gov- Steven Cohen- Microbiological Results of raw Ground Beef Products Analyzed for Escherichia coli O₁₅₇:H₇

25.www.meatsafety.org- Incidence of Foodborne Illness 1996-2005, E.coli O₁₅₇:H₇

26.https://www.cdc.gov- Ongoing Multistate Outbreak of Escherichia coli serotype O₁₅₇:H₇ Infections Associated with Consumption of Fresh Spinach- United States, Septembrie, 2006

- Outbreaks of Escherichia coli O₁₅₇:H₇ Associated with Petting Zoos- Nord Carolina, Florida and Arizona, 2004 and 2005.

- Moore K, Damrow T, Abbott DO- Outbreak of acute gastroenteteritis attributable of E.coli serotype O₁₀₄:H₂₁, 1994

27.https://www.scielo.br- Feng P- Escherichia coli serotype O₁₅₇:H₇ : novel vehicles of infection and emergence of phenotyping variants.

28.www.abdu.ac.uk

29.www.edis.ifas.ulf.edu- H. Petridis, G.Kidder- Potential Sources of E.coli O₁₅₇:H₇ Infection.

30.www.avma.org- Animal issues associated with E.coli O₁₅₇:H_7.

31.www.news.cornell.edu- Acid Relief for O₁₅₇:H₇ Simple change in cattle diets could cut E.coli infection, USDA and Cornell scientists report, 10 sept,1998.

32.www.sfin.ro/ pro si contra iradierii alimentelor. Html

33.Bartleson C.A , J.H Barrett, J. G. Wellss- A multistate outbreak of Escherichia coli O₁₅₇:H₇ -associated bloody diarrhea and haemolytic uremic syndrome from hamburgers- The Washington experience, J.Am.Vet Med.Assoc.,1994

34.Besser R.E si col- An outbreeak of diarrhea and haemolytic uraemic syndrome from E.coli O₁₅₇:H₇ in fresh-pressed apple cider,J.Am.Vet.Med.Assoc.,1993

35.Burnens A.P si col- Case of laboratory acquired infection with E.coli O₁₅₇:H_7, Zbt.Bakt.,1993

36.Chapman P.A. si col- Cattle as a source of Verotoxigenic E.coli O₁₅₇:H_7, Vet Rec, 1992

37.Weagant S.D, J.L. Bryant - Survival of E.coli O₁₅₇:H₇ in mayonnaise-bassed sauces at room and refrigerated temperatures,J. Food Prot,1994

38.Zhao T., Doyle M.P, J.Shere- Prelevance of enterohaemorrhagic E.coli O₁₅₇:H₇ in a survey of dairy herds, Appl.Environ.Microbiol, 1995