DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR PRODUSE DE SPIROCHETE

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR PRODUSE DE SPIROCHETE

Diagnosticul de laborator al sifilisului

Detectia directa a Treponemei pallidum prin microscopia in camp intunecat sau imunofluorescenta directa este indicata cand sunt prezente leziuni, in special in sifilisul primar. Treponemele nu se coloreaza in coloratiile uzuale.

Cultivarea pe medii artificiale nu este posibila.

Diagnosticul serologic este cel mai folosit, fiind indicat in special in sifilisul secundar si tertiar

Microscopia in camp intunecat / Imunofluorescenta directa

Examenul microscopic in camp intunecat se recomanda pentru serozitatea din leziunile de sancru

Imunofluorescenta directa este utila pentru leziuni bucale si anale

Produsul patologic este reprezentat de serozitatea din sancru sau celule lezionale obtinute prin raclaj viguros al leziunii.

La examinarea in camp intunecat , treponemele apar albe, refringente, stralucitoare.

( Fig

Fig.1 Aspectul treponemelor la examenul microscopic in camp intunecat

Avantaje:

Sunt primele care dau rezultate pozitive, inainte de pozitivarea testelor serologice

se obtin rezultate in timp scurt.

Dezavantaje

microscopia in camp intunecat necesita examinarea imediata si un medic cu experienta in microscopie.

Imunofluorescenta necesita reactivi relativi scumpi, microscop cu lampa UV si medic cu experienta in microscopia pentru IF

Rezultate fals negative se pot obtine daca pacientul a inceput tratamentul cu antibiotice pe cale generala

Diagnosticul serologic

este indicat in sifilisul secundar, metodele serologice fiind unicele metode de diagnostic de laborator in sifilisul latent si tertiar

exista doua tipuri de teste serologice:

a. care folosesc antigenul cardiolipina ( non-treponemice) : VDRL, RPR-carbon

b. Care folosesc antigene treponemice specifice: TPHA, FTA-abs. ( fluorescent treponemal antibody absorption), imunoenzimatic ELISA, si teste rapide imunocromatografice, TPPA ( Treponema pallidum particle agglutination)

Teste non-treponemice

teste de screening

rapide si simple din punct de vedere tehnic

VDRL este util pentru LCR

Utile ce indicator de reinfectie

Pot fi efectuate cantitativ, urmarind scaderea titrului ca urmare a unui tratament adecvat

Dezavantaje:

apar la 1-4 saptamani dupa aparitia sancrului

dau rezultate fals pozitive in boli virale, parazitare ( malarie), lepra, autoimune ( LES, tiroidita), sarcina, hepatite cronice, neoplasme in stadiu avansat

rezultate fals negative in pana la 40% din cazuri in sifilisul primar si 25% din cazuri in sifilisul secundar

Teste treponemice

Testele care utilizeaza antigene extrase de la treponemele patogene sunt teste specifice. Acestea sunt folosite ca teste de confirmare, ori de cate ori VDRL sau RPR sunt pozitive

TPHA si FTA-abs sunt foarte sensibile si reprezinta testele de electie

Dezavantaje:

Reactii incrucisate cu treponematozele non-veneriene ( pinta, pianul ), boli tropicale

Nu pot fi folosite in testarea LCR

Nu pot fi folosite in monitorizarea raspunsului la tratament sau aprecierea reinfectiei

PCR ( reactia de amplificare a genomului) este disponibila in anumite centre specializare.

In sifilisul congenital

La nou nascutii cu sifilis congenital sau suspiciune de sifilis congenital, se recolteaza LCR inainte de inceperea tratamentului. Pot exista semnele clinice ( malformatii congenitale, hepatomegalie, splenomegalie).

La mama se efectueaza teste serologice : VDRL sau RPR si TPHA sau FTA-abs.

La copil se efectueaza

testele serologice : VDRL sau RPR si TPHA sau FTA-abs.

Examenul LCR pentru prezenta treponemelor si a anticorpilor ( VDRL sau RPR).

RPR carbon

Principiu

RPR ( rapid plasma reagin) este o reactie de aglutinare intre antigenele reprezentate cardiolipina adsorbita pe suprafata unor particule de carbon si anticorpii anticardiolopinici -" reaginele" - din serul bolnavilor de sifilis.

Tehnica testului calitativ

Sangele se recolteaza, pe nemancate, prin punctie venoasa, in vacuum fara anticoagulant. Se separa serul care trebuie sa fie limpede, serurile lipemice sau hemolizate nefiind adecvate. Serurile se pot pastra prin congelare la minus 20^O C.

Se folosesc placute de carton plastifiat, de unica utilizare, ce au imprimate cercuri cu diametrul de 18 mm.

Se utilizeaza obligatoriu un ser control pozitiv si un ser control negativ.

In momentul efectuarii testului serurile si reactivii trebuie sa fie la temperatura

camerei.

In fiecare cerculet se pipeteaza, cu varfuri separate sau cu pipetele de unica utilizare

din trusa, cite 50 ml ser in fiecare cerculet : ser control pozitiv, ser control negativ si serurile

de cercetat. Se disperseaza fiecare ser pe intreaga suprafata a cerculetului.

Suspensia antigenica se omogenizeaza prin agitarea 10-15 secunde a sticlutei-

dispenser. Cu sticluta in pozitie verticala se depune cate o picatura de antigen in fiecare

cerculet, peste ser.

Se agita prin miscari rotative, cu rotatorul automat la 100 rpm sau manual, timp de

8 minute. ( Fig. 2)

Fig.2. Executarea reactiei RPR- carbon

Citirea rezultatelor se face strict dupa oprirea rotatiei.

Rezultat pozitiv: aglutinare prezenta, in orice grad. Minima, moderata, sau marcata,

intensa. Serul se clarifica si se observa grunjii de culoare neagra.

Rezultat negativ: lipsa aglutinarii, cu prezentei undei de antigen. ( Fig. 3. )

Fig. 3: Modelul de interpretare a reactiei RPR- carbon

++++ +++ ++ + Negativ

Toate serurile pozitive trebuiesc testate printr-o metoda alternativa.

Testul cantitativ

Pentru fiecare ser de testat se foloseste un sir de 5 cerculete.

Se pregatesc serurile de cercetat in dilutii binare: 1.2, 1:4, 1.8, 1:16.

Se pipeteaza cate 50ml ser nediluat si serurile dilute in cite un cerculet.

In continuare se procedeaza similar cu testul calitativ.

Citirea si interpretarea: Ultima dilutie de ser la cere se mai observa aglutinare da titrul

reactiei. De exemplu: Reactie pozitiva, dilutia 1.4

TPHA (Treponema pallidum haemagglutination)

TPHA este o reactie de hemaglutinare pasiva (indirecta) folosita pentru depistarea

anticorpilor indreptati impotriva antigenelor specifice ale treponemelor patogene.

Principiu:

Hematii aviare pe suprafata carora au fost adsorbite antigene de Treponema pallidum

( susa Nichols) sunt suspendate intr-un diluent care impiedica aglutinarea nespecifica.

Hematiile astfel sensibilizate, puse in contact cu serul unui pacient ce poseda

anticorpii corespunzatori, vor aglutina. Reactia poate fi efectuata calitativ sau cantitativ.

Tehnica testului calitativ ( exemplu)

Pentru fiecare ser de testat se foloseste un sir de 4 godeuri.

Se utilizeaza obligatoriu un ser control pozitiv si un ser control negativ.

1.Pentru fiecare ser se pipeteaza diluent: 25ml in godeurile 1,3 si 4 si 100ml in godeul 2.

2. Se adauga 25ml ser in godeul 1, se amesteca si se transfera 25ml in godeul 2; se

amesteca si se transfera cate 25ml in godeurile 3 si 4. Se amesteca si se arunca 25ml din

godeurile 3 si 4. Se realizeaza astfel dilutii de ser de 1:20

3. Se adauga 75 ml suspensie hematii de control ( nesensibilizate ) in godeul 3 si 75 ml

suspensie hematii sensibilizate ( hematii test) in godeul 4.

4. Se amesteca prin lovire usoara sau prin folosire unui agitator mecanic 30 sec.

5. Se acopera placa si se incubeaza la temperatura camerei timp de 1 h, nemiscata.

6. Se citeste reactia.

Tehnica testului cantitativ

Pentru fiecare ser de testat se foloseste un sir de 8 godeuri.

Se realizeaza dilutii binare de ser, ultima fiind de 1:80

Citirea rezultatelor: ( Fig. 4 )

Fig.4. TPHA - aspectul martorilor si schema de interpretare a rezultatelor

: buton de hematii

: buton de hematii cu centrul gol

: pelicula inconjurata de un inel gros de hematii

: pelicula inconjurata de un inel subtire de hematii

: pelicula omogena ce acopera partial fundul godeului

: pelicula omogena de celule, ce acopera tot fundul godeului

Interpretare:

Rezultatul pozitiv ( 1-4+) , indica prezenta anticorpilor specifici antitreponemici,

semnificand o infectie actuala sau in antecedente.

Rezultatul negativ indica absenta anticorpilor , semnificatia fiind, in functie de

rezultatul VDRL, fie absenta infectiei, fie o infectie foarte recenta.

Rezultatele + sunt considerate fie ca negative, fie rezultate la limita, corespunzatoare

unui stadiu precoce sau ca anticorpi reziduali in sifilisul tratat . este indicat sa se repete testarea .

Erorile pot fi date de : reactivi necorespunzatori, seruri hemolizate, rezultate

necorespunzatoare la martorii pozitivi si negativi, erori de tehnica.