Introducere

In anii 1970 propritatile antiinflamatorii ale acidului aristolohic au incurajat dezvoltarea preparatelor farmaceutice in Germania pana ce s-au evidentiat proprietatatile cancerigene pe soarece .

Remediile pe baza de plante, care contin specii ale tipului de Aristolohia au fost recent clasificate ca avand efect cancerigen asupra oamenilor (grupul 1 cancerigen), de catre Agentia Internationala pentru Cercetare in Domeniul Cancerului(IARC) .

Acidul aristolohic este fara doar si poate printre cei mai potenti agenti cancerigeni cunoscuti . In consecinta in 1982 preparatele farmaceutice pe baza de acid aristolohic au fost retrase de pe piata farmaceutica din Germania cat si din multe alte tari . Oricum, speciile de Aristolochia sunt inca folosite in medicina traditionala in multe parti ale lumii . Prin urmare, produsele care contin acid aristolohic au fost interzise la nivel mondial si consumatorii au fost sfatuiti sa intrerupa imediat utilizarea oricaror produse botanice care contin acid aristolohic .

De asemenea, rapoartele in crestere, privind nefropatia acidului aristolohic au punctat inca o data necesitatea de a prezenta asa numitele medicamente "naturale" inofensive ale medicinei naturiste la o evaluare critica a beneficiilor si efectelor secundare inainte de eliberarea lor pentru uz medical, asa cum este obligatoriu pentru medicamentele din lumea occidentala .

Oricum, in ciuda avertizarilor, inca sunt disponibile pe internet destul de multe produse naturiste care contin extracte obtinute din Aristolohia .

In afara cazurilor inregistrate in Belgia, din ce in ce mai multe situatii de aceeasi natura au fost descrise in intreaga lume si toate sunt legate de expunerea la acidul aristolohic . Este o preocupare majora faptul ca aceasta forma a nefropatiei si a tipurilor de cancer asociate poate sa apara mai frecvent in viitor, ca urmare a disponibilitatii pe scara larga de medicamente pe baza de plante care contin acid aristolohic .

PARTEA TEORETICA

I . Date generale privind specia producatoare

I . 1 . Incadrare sistematica

Aristolochia clematitis marul-lupului, dalac , remf, cucurbetica)

Increngatura : Magnoliophyta

Clasa : Magnoliopsida

Ordinul : Piperales

Familia : Aristolochiaceae

Genul : Aristolochia

I . 2 . Raspandire

Este frecventa ca buruiana in vii si livezi, in campurile cultivate si pe marginea drumurilor (mai ales in judetele: Arad, Bistrita-Nasaud, Caras-Severin, Cluj, Mures, Sibiu, Timis, Mehedinti, Dolj, Gorj, Valcea, Ialomita, Ilfov, Prahova, Bacau, Galati, Iasi, Neamt, Vaslui) . (wikipedia)

Po>>

I . 3 . Descrierea speciei

Planta volubila frecventa prin tufarisuri, cranguri,zavoaie, vii, margini de drumuri si paduri la campie si deal . Are in sol un rizom cilindric, scurt si ramificat, galben-brun din care pornesc radacini adventive . Tulpina este erecta cu noduri evidente la nivelul carora se indoaie in zig-zag . Frunzele sunt oval triunghiulare, cu baza adanc cordata, varf rotunjit, pieloase, lung-petiolate, alterne . Florile sunt hermafrodite, zigomorfe, cate 3-5 la axila frunzelor . Periantul este tubulos, palid-galbui, dilatat la baza, iar la varf terminat cu o prelungire ligulata . In interiorul tubului periantului se

gasesc peri rigizi cu varful indreptat in jos, care impiedica iesirea insectelor care patrund in interior . Abia dupa polenizare, perii se usuca eliberand insecta captiva . Androceul are 6 stamine concrescute cu gineceul din 6 carpele . Acesta din urma are ovar inferior, stil scurt si un stigmat in forma de disc cu 6 lobi . Fructul este globulos, galben-verzui, deschizandu-se prin 6 valve . Botanica farmaceutica

Fig nr Fig nr

Aristolochia clematitis-detalii Aristolochia clematitis -floare

Inmultirea

Se inmulteste prin seminte, obtinute prin polenizare artificiala si prin butasi in rasadnita calda .

Recoltarea

Rizomul plantei (Aristolochiae rhizoma) se recolteaza toamna catre sfarsitul perioadei de vegetatie . Se scoate din pamant cu cazmaua . Se spala intr-un curent de apa(daca este cazul) . Se usuca in poduri acoperite cu tabla,in strat subtire . Uscare artificiala la 50-60 ⁰ C . Se pastreaza in pungi sau saci de hartie .

Partile aeriene(Aristolochiae herba) se recolteaza in timpul infloririi in lunile mai-iunie prin taierea partii foliate a plantei . Se usuca si se pastreaza la fel ca rizomul .

Semintele (Aristolochiae semen ) se recolteaza la sfarsitul lunii iulie inceputul lunii august prin culegerea fructelor . Fructele se usuca la soare iar pe timp nefavorabil in incaperi . Pe masura uscarii se freaca pentru eliberarea semintelor . Peretele fructelor se indeparteaza de seminte prin vanturare . Sursa (Universul Plantelor, pag 177,Constantin Parvu 1997)

I . 4 . Definitia si descrierea produsului vegetal herba

poza aceasta nu aici, ci la partea practica (e facuta de tine)

Sub denumirea de Aristolochiae herba se intelege partea aeriana recoltata in timpul infloririi de la specia Aristolochia clematitis L .

(pag 137 ,Istudor, vol 3)

Definitia si descrierea produsului vegetal rhizoma

nu stiu unde pot gasi date despre rizom (stiintific vorbind)?

Cred ca ai avut ceva in lucrarea de doctorat; mai poti cauta in Istudor, vol . III

Definitia si descrierea produsului vegetal herba

1 . 5 Compozitia chimica

Aristolochiae herba contine : nitroderivati fenantrenici ( acid aristolochic I si II) (Fig 1 si fig2) . Spenser si colaboratorii au studiat biosinteza acidului aristolochic II in Aristolochia sipho si au demonstrat ca precursorii acestuia au fost tirosina, DOPA si noradrenalina . Gruparea nitro a acizilor provine din radicalul amino al tirosinei .

Acid aristolochic I

Fig 1

Acid aristolochic II

Fig 2

Alcaloizi izochimolinici (magnaflorina,corituberina,curina)

Magnoflorina Corituberina

Fig 3

Argentinina

CICLANOLINA

Fig 4

Aristolochina (L-curina)

Fig 6

Ulei volatil 0 . 03-0 . 2% . Cantitatea de ulei volatil difera de organ: radacina are un continut mai mare decit frunzele ,atit in stare uscata cat si proaspata . In general cantitatea de ulei volatil este mai mare in planta uscata decat in cea proaspata . In afara de unii alcooli(alcool izoamilic,alcool cinamilic,cetone(metil-nonil-cetona),acizi(acid valerianic) si esteri(propionat de linalil,metil -antranilat de metil) din seria alifatica sau aromatica semnalati inA clematitis . In reticulata,clematitis si indica s au stabilit prezenta monoterpenoidelor si a sesquiterpenoidelor,unele dintre ele fiind caracteristice numai familiei Aristolochiaceae . Din care compusii dominanti (α-pinenul si α-terpineolul) sunt insotiti de borneol,cadinen ,aristolona ,aristolactona si alti derivati .

α-pinen CADINEN

BORNEOL

Fig 7  Fig 8 Fig 9

α-terpineol

Fig 10

Aristolona C15H22O

aRISTOLACTONA

Taninuri

Acizi polifenolcarboxilici(acid cafeic,acid clorogenic,acid sinapic)

Fig 11 Acid clorogenic acid CAFEIC ACID SINAPIC

Fig 12

Aristolactame (aristored)  Acid chinic

Alantoina

Alantoina si acidul alantoic sunt produsi de degradare ai purinelor . Glicozidele purinice (alaturi de glicozidele pirimidinice) intra in constitutia nucleozidelor,ai carei esteri fosforici sunt nucleotidele . Polimerii superiori ai acestora sunt acizii nucleici .

Acizi-fenoli,Acizi-alcooli

Acidul p-cumaric

Aminoacizi liberi

Au fost pu i in eviden a un numar de 15 acizi liberi: glicina,serina ,treonina, acidul-γamino butiric ,valina, leucina, fenilalanina, tirosina, acidul aspartic, acidul glutamic, glutamina, lisina, histidina si prolina .

Sitosterol

1 . 6 Actiunea terapeutica

Aristolochia clematitis actioneaza prin acizii aristolochici similar colchicinei . (Istudor, pag 137)

Acizii aristolochici activeaza metabolismul si fagocitoza (efecte demonstrate pe obolani si cobai) .

-cresc productia de limfokine si prin ele proprietatile bactericide ale serului .

-este stimulata β-lisina .

-efect antiviral pe virusul Herpes simplex,cu localizare oculara .

-stimularea si formarea de tesut granular .

-cresterea ratei de supravietuire la infectii ( Istudor, pag 135) .

- actiune spasmolitica :In experientele pe intestin izolat,stimulat cu acetil-colina sau cu histamina,acidul aristolochic are un efect de inhibare dar efectul este nul in cazul stimularii cu ioni de bariu (doctorat, pag 106) .

-actiune directa pe miocard in starile patologice , vasodilatatie periferica si coronariana ,toate acestea fiind atribuite flavonolglicozidelor .

-cresterea presiunii arteriale fara modificari ale ritmului contractiilor si ale respiratiei (doctorat pag 107) .

-stimuleaza epitelizarea (botanica farmaceutica) .

oligomenoree .

-dismenoree, sterilitate, , stimularea corpului galben in tulburarile de menopauza .

-Homeopatic micsoreaza timpul de sangerare .

-La administrari repetate acizii aristolochici se acumuleaza in organism, in circulatia enterohepatica si provoaca un efect favorabil de lunga durata asupra unor infectii cronicizate constand din fistule anale, fistule dentare, plagi greu vindecabile . Au actiune antibiotica si antitumorala .

I . 7 Actiunea toxica

S-a investigat inducția aberatiilor structurii cromozomiale și schimbarile cromatidei surori(SCEs) determinate de acidul aristolohic in limfocitele umane in vitro . Celulele erau tratate cu agentul testat de-a lungul intregului proces si de-a lungul fazei G0 a ciclului celulei . S-au testat concentratiile peste media de 1 pana la 20 micrograme/ml . Ambele conditii ale tratamentului au avut drept rezultat cresterea frecventei aberatiilor . Inductia golurilor si a rupturilor, la fel ca si inductia SCEs au demonstrat o crestere dependenta a dozei . Numarul SCE-urilor pe metafaza a fost sporit de un factor de 2 pana la 3 . Daca metodele citogenetice conventionale ar fi fost aplicate din timp, una dintre ele ar fi recunoscut mai devreme riscul mutagenic al acidului aristolohic .

PMID: 6885046 [PubMed - indexed for MEDLINE]

https://www . ncbi . nlm . nih . gov/pubmed/6885046?itool=EntrezSystem2 . PEntrez . Pubmed . Pubmed_ResultsPanel . Pubmed_RVDocSum&ordinalpos=6

Așa numita nefropatie a plantelor medicinale chinezesti(CHN) asociata cu ingerarea (inghitirea) medicamentelor(remediilor) care au la baza plantele medicinale chinezesti a fost pentru prima data expusa(relatata, adusa la cunostinta publica) in 1993 prin cazuri succesive de insuficienta renala, toate tratate pentru pierderea greutatii in aceeasi clinica din Belgia .

Din 39 de pacienti cu nefropatia plantelor chinezesti aflati in stadiul final al insuficientei renale(un procent de 46%) care au suferit indepartarea profilactica a rinichilor si ureterelor, 18 dintre ei au fost diagnosticati cu tumori uroteliale .

Doza cumulative de Aristolohia a fost un factor de risc semnificativ; pacientii cu un aport de 200g de plante(media aportului de plante) au avut un risc de 50% de a dezvolta cancer .

Asa numita nefropatie a plantelor medicinale chinezesti a fost identificata la pacientii din alte tari europene(de ex : UK, Franta, Spania si Germania) si asiatice si in SUA, care au fost expusi la speciile de Aristolohia care contin acid aristolohic si care nu aveau nici o legatura cu grupul studiat din Belgia .

In cazul multor pacienti cu nefropatie uroteliala cauzata de acidul aristolohic, au fost diagnosticate tumori, evidentiand potentialul cancerigen al acidului aristolohic la fiintele umane .

Mecanismul actiunii toxice- Unde sa il incadrez?

AA biotransformation

(cytochrome P450)

Schmeiser HH, Arlt VM . Cancer Res (1996)(SURSA) https://www . nephro-necker . org/pdf/2009/08_Nortier_28_avril . pdf

https://www . nephro-necker . org/pdf/2009/08_Nortier_28_avril . pdf

neaparat uitati va pe acest site

Ambele enzyme citozolice umane (de ex: NQ 01) si enzimele microzomiale(de exemplu: CYP1A1 si CYP1A2) activeaza acidul aristolohic printr-o nitroreductie simpla care conduce la specii de legatura cu AND-ul .

De asemenea, una dintre enzimele metabolice este PHS , care este extrem de prezenta in tesuturile uroteliale .
In mod interesant, pana in prezent numai 50% dintre pacientii din Belgia, care au fost supusi acestei diete au suferit de nefropatie .

O posibila explicatie pentru raspunsurile diferite ale pacientilor ar putea fi data de diferentele activitatilor de biotransformare a enzimelor catalitice(activare si/sau detoxificare) a acidului aristolohic .

In cazul pacientilor cu nefopatia acidului aristolohic atipicul urotelial a fost asociat cu excesul proteinei P53, sugerand ca gena P53 a suferit o mutatie in prezenta acidului aristolohic .

Peste 50% dintre tumorile umane contin o mutatie in gena p53 . In mod interesant, in cazul unui pacient cu nefropatia acidului aristolohic,disponibil pentru a analiza o mutatie transversala caracteristica de la A la T (este inlocuita adenina cu timina) a fost descoperita in gena P53 din celulele tumorale uroteliale . (ma gandesc si la alte formulari mai clare)

In mod interesant, intr-o linie celulara a fost gasita o traslatie de la A la T caracteristica pentru prima adenina din codonul 139(AAG) identice cu mutatia descoperita celulelor tumorale uroteliale ale pacientului cu nefropatia acidului aristolohic, inca disponibil pentru analizarea mutatiei . (comparatie om șoarece)

Doza letala DL50

Administrarea de acid aristolohic i . v sau p . o in doze ridicate a fost urmata in 15 zile de moartea animalelor testate prin insuficienta renala . LD₅₀ ranged from 56 to 203 mg/kg orally or 38 to 83 mg/kg intravenously, depending on species and sex .

Histologic: the predominant features were severe necrosis affecting the renal tubules, atrophy of the lymphatic organs and large areas of superficial ulceration in the forestomach, followed by hyperplasia and hyperkeratosis of the squamous epithelium .

Received: 30 June 1986  Accepted: 10 October 1986  

Tratamentul intoxicatiei acute cu acid aristolohic

: IV sodium bicarbonate for acidosis, prednisolone to slow down kidney disease

Spalaturi stomacale cu car­bune activ, tanin 2%, diure­tice si lichide multe . Opiacee

1 . 8 Intrebuintari

In medicina tradi ionala chineza este folosita in dureri articulare si stomacale ,malarie si abces . (istudor)

Se mai intrebuin eaza in algii gastro-intestinale si colici biliare .

Este foarte folosita in medicina homeopata , in tulburari ginecologice si climacterice,afectiuni ORL,plagi si ulcere,dupa interventii chirurgicale majore . (istudor)laringite, faringite,bronsite cronice, ulceratii de decubitus, osteomielita . (botanica farmaceutica)

Contemporary

medicine has used Aristolochia plant

extracts for therapy of arthritis, gout,

rheumatism and festering wounds .

1 . 9 Preparate farmaceutice

Tinctura de marul lupului Dacia Plant (M am interesat si nu primeste APP) Sa fac fotografii la ce exista deja dar sunt distribuite ilegal? Pana si vanzatoarea a spus ca i ilegal ce face

II Date privind alte specii de Aristolochia

Alte specii de Aristolochia utilizate

Aristolochia reticulata de la care se folosesc rizomul si radacinile uscate,recoltate din padurile din Texas,Louisiana,Arkansas,Oklahoma,cunoscut in comert ca Texan sau Red river snake-root .

Aristolochia serpentina de la care se obtine sortul Virginian snake-root,este considerat impuritate a produsului Red river snake-root

Aristolochia sipho

Aristolochia indica (radacini si rizomi) care pe langa acizii aristolochici mai conține N-glicozide și derivați sterolici .

Raspandirea geografica a speciilor din genul Aristolochia cu utilizari terapeutice

Compoziția chimica a unor specii de Aristolochia comparativ cu specia studiata

Acizii fenoli si acizii alcooli din genul Aristolochia

In tuberculii de Aristolochia rotunda a fost semnalata asparagina prin cromatografia uni si bi dimensionala (doctorat) .

Alantoina este frecvent intalnita in speciile:A . Cymbifera,A debilis,A indica ,A reticulata .

In cazul oleurilor esențiale se cunosc caracteristicile fizico-chimice numai pentru speciile A aerpentaria,A reticulata,A indica,A clematitis .

Oleuri esentiale : compozitia chimica comparativ cu Aristolochia clematitis

Dintre monoterpenoide s-au pus in evidenta unele hidrocarburi: alfa-pinenul in A reticulata si A clematitis,o cetona d-camforul in A indica si alcolii :borneolul in A . reticulata .

Acidul p-cumaric sub forma a 4 esteri glicozidici prezenti in A . Sipho .

PARTEA EXPERIMENTALA

III Analiza farmacognostica a produsului vegetal Aristolochie herba

III . 1 Determinarea identitații

III . 1 . 1 Examen macroscopic

Examenul macroscopic se realizeaza in scopul stabilirii caracterelor morfologice (observate cu ochiul liber sau cu lupa) si organoleptice (percepute prin miros si gust) ale produsului vegetal . ¹¹

Rezultate :

In produsul vegetal analizat se pot observa:

fragmente de tulpina de aproximativ 2-3 cm lungime si 1 cm latime;

fragmente de frunze cu dimensiunea de aproximativ 3-4 cm, de culoare verde brun pe partea superioara,verde-galbui pe partea inferioara;

frunze intregi pe iolate cu striuri longitudinale, nerva iune reticulata, margine intreaga, usor crenelat;

fragmente de tulpini fistuloase de 1-2 . 5 cm lungime si 3 mm grosime, striate longitudinal, de culoare verde-galbuie;

boboci florali cu dimensiuni de 1-2 mm, culoare galbena, inso i i de bractee mici, brune;

mirosul produsului vegetal este slab lesios,usor in epator

Fig 18 . Aristolochie herba-produs vegetal uscat

II . 1 . 2 . Examen microscopic

Examenul microscopic are ca scop stabilirea esuturilor si elementelor anatomice caracteristice unui anumit tip de produs vegetal . Se poate realiza pe sectiune transversala, preparat superficial (concissum) clarificat si pulbere clarificata . Din cele trei posibilitati am optat pentru preparatul microscopic de tip preparat superficial .

Principiul metodei: Se aplica pentru produsele vegetale moi si subtiri de tipul folium, flores si herba . Dupa o prealabila clarificare (indepartare a continutului celular prin tratare cu solutie de NaOH 50-100 g/L), se observa la microscop elementele anatomice comune si specifice . ¹¹

Tehnica de lucru: fragmente mici de produs vegetal se aduc la fierbere cu NaOH 50g/L . Dupa racire, se spala cu apa distilata, se pun pe o lama de microscop si se zdrobesc cu ajutorul unui ac spatulat . Se aplica lamela, prin usoara presare si se examineaza la microscop . ¹¹

Rezultate

Elementele anatomice observate sunt:

Elemente comune unui p . v de tip herba:

Din floare

Fragmente de endoteciu (figura nr . 4) ;

Papile (figura nr . 2);

Grauncioare de polen (figura nr . 3 . );

Din frunza

Fragmente de epiderma cu stomate (figura nr . 1);

Vase de lemn de calibru mic (figura nr2);

Fragmente de parenchim clorofilian (figura nr . 4) .

Elemente specifice:

grauncioare de polen sferice cu exina neteda (figura nr . 5);

stomate de tip anomocitic;

cristale de oxalat de calciu (figura nr . );

II . 1 . 3 . Examen microchimic

Principiul metodei: Cumarinele au proprietatea de a microsublima . ¹¹

Tehnica de lucru: produsul vegetal adus pe o lama de microscop se umecteaza cu acid clorhidric 100 g/L (se obtine o pasta omogena) si se supune sublimarii direct in flacara . Microsublimatul obtinut se examineaza la microscop dupa care se solubilizeaza in metanol . Solutia obtinuta se imparte in doua, una va reprezenta martorul iar cealalta proba peste care se adauga NH₄OH . Cele doua eprubete se examineaza la UV la 365nm . ¹¹

Rezultate

Reactie pozitiva . In urma examinarii celor doua eprubete la UV se observa o fluorescenta verzuie, mai intensa in mediul alcalin .

Concluzie: produsul vegetal corespunde cu descrierea din literatura de specialitate privind continutul in cumarine .

II . 1 . 4 . C . Analiza solutiei extractive apoase

S-a lucrat conform schemei de separare prezentate in Anexa 2 .

Mod de lucru:

Oze

Reactia cu reactivul Fehling are la baza proprietatea ozelor de a reduce hidroxidul amino-cupric la oxid cupros . ¹¹

Tehnica de lucru: peste 1 ml solutie extractiva adusa in prealabil in eprubeta se adauga 1 ml reactiv Fehling ( obtinut prin amestecarea ex-tempore a 0,5 ml reactiv Fehling I cu 0,5 ml reactiv Fehling II) . Amestecul se incalzeste la flacara mica . Se observa aparitia unui precipitat rosu-caramiziu, care sedimenteaza in timp . ¹¹

Reactia Molish : sub actiunea acidului sulfuric concentrat, ozele se deshidrateaza, cu formarea furfuralului (pentozele) sau hidroximetil-furfuralului (hexozele) . Acestia, prin cuplare cu timol, genereaza compusi colorati in rosu-purpuriu . ¹¹

Tehnica de lucru: 3-5 ml solutie extractiva se concentreaza in capsula pana la sicitate . Peste reziduul format se adauga 1 ml acid sulfuric concentrat si proba se mentine in repaus cel putin 5 min, dupa care se trateaza cu 1-2 picaturi timol . Se formeaza un compus colorat in rosu-purpuriu sau rosu-portocaliu in functie de concentratia ozelor din proba . ¹¹

Rezultate: reactii pozitive .

Concluzie: produsul vegetal contine oze .

Poliholozide (mucilagii)

Reactia cu hematoxilina: mucilagiile se coloreaza in violet in prezenta hematoxilinei . ³

Tehnica de lucru: intr-o eprubeta cu 10 ml metanol sau acetona, se toarna in fir subtire, sub agitare, 2-3 ml solutie apoasa concentrata . Precipitatul format se separa prin filtrare si se aduce intr-o eprubeta . Se adauga 1-2 picaturi hematoxilina . Apare o coloratie violeta . ¹¹

Reactia Molish: sub actiunea acidului sulfuric concentrat mucilagiile se depolimerizeaza formand oze, iar ozele se deshidrateaza, cu formarea furfuralului (pentozele) sau hidroximetil-furfuralului (hexozele) . Acestia, prin cuplare cu timol, genereaza compusi colorati in rosu-purpuriu . ¹¹

Tehnica de lucru: 3-5 ml solutie extractiva se concentreaza in capsula pana la sicitate . Peste reziduul format se adauga 1 ml acid sulfuric concentrat si proba se mentine in repaus cel putin 5 min, dupa care se trateaza cu 1-2 picaturi timol . Se formeaza un compus colorat in rosu-purpuriu sau rosu-portocaliu in functie de concentratia ozelor din proba . ¹¹

Rezultate: reactii pozitive .

Concluzie: produsul vegetal contine mucilagii

Proantociani

Reactia Bath-Smith: in mediul acid, la cald, proantocianii se transforma in antocianii corespunzatori . ²³

Observatie : Dupa realizarea hidrolizei solutiei extractive apoase s-a incercat identificarea proantocianilor prin compararea martorilor din solutia hidrolizata si din solutia nehidrolizata . In cazul produsului de cercetat martorul din solutia hidrolizata a fost mai putin colorat decat martorul solutiei nehidrolizate . ¹¹

Rezultate: reactie pozitiva .

Concluzie: produsul vegetal contine proantociani .

Taninuri

Reactia cu clorura de fer (III) : in prezenta cationului Fe (III) taninurile catehice formeaza precipitate si/sau coloratie verde-negricioasa, iar cele galice precipitate si/sau coloratie albastra-negricioasa . ¹¹

Tehnica de lucru: la 1 ml solutie extractiva se adauga 0,5 ml solutie clorura de fer (III) . Se observa aparitia precipitatului sau coloratiei in functie de tipul de tanin . ¹¹

Observatie:

Daca in solutie exista ambele tipuri de tanin, reactia devine neconcludenta si trebuie realizata separarea lor . Aceasta separare are ca principiu precipitarea taninurilor catehice in prezenta de R . Styassny (formaldehida si acid clorhidric) si identificare, in solutia neutralizata a taninurilor galice, prin tratare cu FeCl₃ . ¹¹

Reactia cu ionii metalelor grele : are la baza proprietatea taninurilor de a precipita cu ionii metalelor grele . ¹¹

Tehnica de lucru: la 1 ml solutie extractiva se adauga 1 ml solutie acetat de plumb (II) . Se observa aparitia unui precipitat brun . ¹¹

Observatie:

Reactia nu este specifica deoarece si alte principii active (ex . flavonozide, saponozide) precipita cu ionii metalelor grele .

Reactia cu reactivul Styassny caracteristica taninurilor catehice): in prezenta reactivului Styassny (aldehida formica si acid clorhidric concentrat 3:1), taninul catehic precipita, cu formare de compusi galbeni bruni . ¹¹

Tehnica de lucru: la 6 ml solutie extractiva, se adauga 3 ml solutie formaldehida si 1 ml acid clorhidric concentrat . Se lasa pe baie de apa 30 min . Aparitia unui precipitat galben brun e corelata cu taninul catehic . In filtrat se poate cerceta taninului galic (dupa neutralizarea solutiei) . ¹¹

Reactia de formare a flobafenelor : taninurile catehice condenseaza in mediu de acid mineral concentrat, cu formarea de flobafene (precipitate rosii brune) . ¹¹

Tehnica de lucru: 2 ml solutie extractiva se trateaza cu 2 ml HCI 100 g/L . Se mentine 10 min pe baie de apa . Se obtine un precipitat rosu- brun . ¹¹

Rezultate

Dupa precipitarea taninului catehic cu reactiv Styassny, filtratul obtinut nu da reactie pozitiva cu clorura de fer(III), deci taninurile galice nu sunt prezente in produsul vegetal . Reactii pozitive numai pentru taninurile catehice .

Concluzie: produsul vegetal contine taninuri catehice

Saponozide

Reactii de precipitare cu hidroxid de bariu, acetat bazic si neutru de plumb: saponozidele formeaza cu hidroxid de bariu, acetat bazic si neutru de plumb precipitate albe, insolubile in exces de reactiv . ¹¹

Tehnica de lucru: la 1ml solutie extractiva se adauga 0,5 ml reactiv . Aparitia unor precipitate alb-galbui indica prezenta saponozidelor . ¹¹

Proba spumefierii: o solutie apoasa continand saponozide, prin agitare energica timp de 15 minute denota prezenta saponozidelor . ¹¹

Tehnica de lucru: 5 ml solutie extractiva se agita 15 secunde, apoi se lasa in repaus . Existenta unei spume si dupa 15 minute denota prezenta saponozidelor . ¹¹

Observatie:

Reactiile de precipitare cu Ba(OH)₂, acetat bazic si neutru de plumb si proba spumefierii nu sunt specifice saponozidelor, de aceea se impune efectuarea reactiei Liebermann-Burchard pe solutia hidrolizata (faza apolara) .

Reactia Liebermann-Burchard Reactie efectuata pe solutia apoasa hidrolizata-faza apolara

Reactia Liebermann-Burchard in prezenta anhidridei acetice si a acidului sulfuric concentrat, compusii cu nucleu sterolic sufera reactii de deshidratare, dehidrogenare si dimerizare, finalizate cu formarea unui dimer colorat in verde . ¹¹

Tehnica de lucru: 5ml solutie extractiva cloroformica se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de nisip . Reziduul se reia cu 2 ml anhidrida acetica, iar solutia rezultata se imparte in doua eprubete: o eprubeta constituie martorul, iar a doua - proba de analizat . Peste proba se aduc 1-2 ml acid sulfuric concentrat, la partea inferioara a eprubetei . La zona de contact a celor doua lichide apare un inel rosu-brun, iar stratul superior se coloreaza dupa 5-10 minute in verde (steroli) sau rosu-violet (triterpene) . ¹¹

Rezultate: reactii pozitive pentru agliconi sterolici (se obtine un inel brun si strat superior verde) .

Concluzii: produsul vegetal contine saponozide sterolice

Identificarea flavonozidelor si a agliconilor acestora

Observatii:

Identificarea flavonozidelor a fost efectuata in solutia apoasa initiala .

Identificarea agliconilor flavonozidelor a fost efectuata in solutia apoasa hidrolizata, faza apolara, dupa dizolvarea reziduului acesteia in alcool (vezi Anexa 2) .

Reactiile de identificare sunt comune atat pentru flavonozide cat si pentru agliconii acestora .

Formarea fenoxizilor : flavonozidele si agliconii formeaza in mediu alcalin fenoxizi colorati in galben . ¹¹

Tehnica de lucru: la 1 ml solutie extractiva apoasa/alcoolica se adauga 0,5 ml solutie hidroxid de sodiu 100g/L . Se observa intensificarea coloratiei galbene . ¹¹

Reactia Schibata (reactia cianidolului) : proprietatea flavonozidelor sau a agliconilor acestora de a-si reduce gruparea ceto in prezenta hidrogenului nativ . ¹¹

Tehnica de lucru: la 1 ml solutie extractiva apoasa/alcoolica se adauga cateva fragmente de magneziu metalic si 0,5 ml solutie de acid clorhidric concentrat . Reactia e insotita de efervescenta . Modificarea culorii are loc in decurs de cateva minute . Se formeaza o coloratie portocalie (in cazul flavonelor) sau rosie (in cazul flavonolilor) . ¹¹

Reactia de obtinere a chelatilor : proprietatea flavonozidelor sau a agliconilor acestora de a forma in prezenta metalelor bi- si trivalente chelati colorati in galben . ¹¹

Tehnica de lucru: la 1 ml solutie extractiva apoasa/alcoolica se aduga 0,5 ml solutie de acetat de sodiu 100g/L si 1 ml solutie clorura de aluminiu 25 g/L . Se observa intensificarea coloratiei galbene . ¹¹

Rezultate: reactii pozitive atat pe solutia aposa initiala, cat si pe solutia apoasa hidrolizata, faza apolara .

Concluzie: produsul vegetal contine flavonozide si agliconi flavonici .

Antocianozide

Reactia virajului de culoare: prin variatia pH-ului au loc modificari structurale insotite de modificarea culorii (vezi schema de mai jos) . ¹¹

Tehnica de lucru: la 1 ml solutie extractiva apoasa se adauga 1-2 picaturi solutie de HCl 1 mol/L si se observa intensificarea coloratiei rosii . La adaugarea treptata a NaOH 100 g/L se observa modificarea culorii la violet-cenusiu, apoi albastru, si in final galben . Pana la pH<12 reactiile sunt reversibile prin adaugarea de HCl 1 mol/L . ¹¹

Rezultate: reactii negative .

Concluzie: produsul vegetal nu contine antocianozide .

Alcaloizi

Reactiile de precipitare cu reactivii generali :in prezenta reactivului alcaloizii saruri formeaza precipitate .

Tehnica de lucru: peste 1 ml solutie apoasa acida se adauga treptat (pic cu pic) reactivul de precipitare (1-2pic)si se urmareste modificarea aspectului solutiei in raport cu o solutie martor . In cazul unei reactii pozitive se formeaza un precipitat .

Observatii:

-in cazul reactiilor cu reactivii Mayer si Bertrand se formeaza precipitate albe sau albe-galbui,solubile in exces de reactiv;de aceea reactivul se adauga treptat,in volume mici;

-in cazul in care proba are un continut mic de alcaloizi,se va observa doar o opalescenta 3-4,nu un precipitat .

Extractia alcaloizilor prin metoda Stas-Otto varianta cu solvent polar

Tehnica de lucru: 1 g produs vegetal,adus in prealabil la gradul de maruntire corespunzator,se umecteaza cu solutie de amoniac 100 g/L ,pana la formarea unei paste omogene . Dupa uscare (prin etalare in strat subtire pe o placa de sticla)acesta se extrage cu 10 mL eter etilic . Solutia extractiva eterica se anhidrizeaza(prin trecere pe sulfat de sodiu scc . ) si apoi se transvazeaza intr-o palnie de separare . Se agita cu 3-4 Ml acid clorhiric 20 g/L si se retine solutia aposa acida . Aceasta se alcalinizeaza cu solutie de amoniac 100 g /L pana la pH 8-9 (verificare cu hartia indicator) si apoi se extrage cu 3-4 mL eter etilic . Solutia eterica se agita cu 3-4 Ml acid clorhidric20 g/L (in palnia de separare) si se retin cele 2 solutii: solutia apoasa acida si solutia eterica reziduala . In solutia eterica se va verifica prezenta alcaloizilor . Pentru aceasta,solutia eterica reziduala se agita intr-o palnie de separare cu 3-4 Ml acid clorhidric 20g/L si pe solutia astfel separata se efectueaza reactiile de precipitare ale alcaloizilor . Daca acestea sunt pozitive se repeta operatia de purificare a solutiei apoase acide separate odata cu solutia eterica reziduala-alcalinizare,extractie cu eter etilic,agitare cu acid clorhidric 20g/L a solutiei etrice,separare faza apoasa acida . Purificarea se repeta pana cand in solutiile eterice reziduale reactiile de identificare ale alcaloizilor sunt negative . In acest moment solutia apoasa acida poate fi considerata purificata .

Rezultate: reactii pozitive

Concluzii: produsul vegetal contine alcaloizi .

ANALIZA SOLUTIEI EXTRACTIVE ETERICE

Obtinerea solutiei: 10 g produs vegetal uscat se supun extractiei cu 50 mL eter etilic, la rece, timp de 24 ore . Dupa filtrare se cerceteaza in solutia eterica principiile active liposolubile: agliconi cumarinici, emodoli, steroli, carotenoide si rezine .

Agliconi cumarinici

Proba fluorescentei proprietatea de a emite fluorescenta verde, albastra sau violeta in lumina UV, mai intensa prin alcalinizare, cand se formeaza saruri ale acidului o-hidroxicinamic sau ale derivatilor sai . ¹¹

Tehnica de lucru: 2-3 ml solutie eterica se aduc la reziduu intr-o capsula de portelan . Reziduul se dizolva in metanol sau apa calda; in doua eprubete se aduc cate 2 ml solutie de analizat . Intr-una din ele se adauga 1 ml NaOH 100 g/L . Se examineaza ambele eprubete la UV si se observa fluorescenta caracteristica, mai intensa in mediu alcalin . ¹¹

Rezultate: reactii pozitive .

Concluzie: produsul vegetal contine agliconi cumarinici .

Emodoli

Reactia Borntrager: emodolii 1,8 dihidroxilati, forme oxidate, formeaza in solutii apoase alcaline emodinati de culoare rosie-violeta . ¹¹

Tehnica de lucru: peste solutia eterica se adauga 1 ml solutie NaOH 10% . Daca reactia este pozitiva stratul inferior apos se coloreaza in rosu, iar cel superior, apolar se decoloreaza . ¹¹

Rezultate: reactie negativa .

Concluzie: produsul vegetal nu contine emodoli .

Steroli si triterpene libere

Reactia Liebermann-Burchard in prezenta anhidridei acetice si a acidului sulfuric concentrat, compusii cu nucleu sterolic sufera reactii de deshidratare, dehidrogenare si dimerizare, finalizate cu formarea unui dimer colorat in verde . ¹¹

Tehnica de lucru: 5ml solutie extractiva eterica se evapora intr-o capsula de portelan, pe baia de nisip . Reziduul se reia cu 2 ml anhidrida acetica, iar solutia rezultata se imparte in doua eprubete: o eprubeta constituie martorul, iar a doua - proba de analizat . Peste proba se aduc 1-2 ml acid sulfuric concentrat, la partea inferioara a eprubetei . La zona de contact a celor doua lichide apare un inel rosu-brun, iar stratul superior se coloreaza dupa 5-10 minute in verde (steroli) sau rosu-violet (triterpene) . ¹¹

Rezultate: reactii pozitive inainte si dupa hidroliza (reactia Liebermann-Burchard pozitiva pentru agliconi sterolici - se obtine un inel brun) .

Concluzii: produsul vegetal contine saponozide sterolice .

Carotenoide

Reactia Carr-Price la tratarea cu triclorura de stibiu, carotenoidele formeaza compusi colorati in albastru, care trec in rosu-purpuriu si apoi in rosu-brun . ¹²

Tehnica de lucru: solutia extractiva eterica se aduce la reziduu, intr-o capsula de portelan, pe baia de apa . Peste reziduu se adauga 1-2 picaturi reactiv Carr-Price . Daca reactia este pozitiva se observa aparitia unei coloratii albastre . ¹²

Reactia Winterstein la tratarea cu acid sulfuric concentrat carotenoidele formeaza compusi colorati in albastru-verzui . ¹²

Tehnica de lucru: 1-2 ml solutie extractiva apolara se aduc la reziduu, intr-o capsula de portelan, pe baia de apa . Dupa racire, peste reziduu se adauga 1-2 picaturi acid sulfuric concentrat . Daca reactia este pozitiva apare o coloratie albastra-verzui . ¹²

Reactia cu acidul clorhidric concentrat: la tratare cu acid clorhidric concentrat carotenoidele cu structura epoxidica formeaza compusi colorati in verde-albastrui . ¹²

Tehnica de lucru: 1-2 ml solutie extractiva apolara se aduce la reziduu, intr-o capsula de portelan, pe baia de apa . Dupa racire, peste reziduu se adauga 1-2 picaturi acid clorhidric concentrat . Daca reactia este pozitiva se observa aparitia unei coloratii verde-albastrui . ¹²

Rezultate: reactii pozitive .

Concluzie: produsul vegetal contine carotenoide .

Rezine

Reactia Hrischsohn: in prezenta acetatului de cupru, acizii rezinici se transforma in rezinati, de culoare verde-smarald .

Tehnica de lucru: 1-2 ml solutie extractiva eterica se agita cu 0,5 ml acetat de cupru 0,1 mol/L . In cazul unei reactii pozitive stratul apos devine verde smarald .

Rezultate: reactie negativa .

Concluzie: produsul vegetal nu contine rezine

REZULTATE GENERALE ALE EXAMENULUI CHIMIC CALITATIV

In solutia extractiva apoasa am identificat urmatoarele principii active:

Oze

Mucilagii

Proantociani

Taninuri

Saponozide

Flavonozide

Alcaloizi

In solutia extractiva eterica au fost identificate principiile active:

Cumarine

Steroli si triterpene

Carotenoide

Tabelul I . Compararea principiilor active identificate in produsul vegetal cu cele mentionate in literatura de specialitate

Concluzii

Produsul vegetal analizat corespunde, din punct de vedere al continutului in principii active cu descrierile din literatura de specialitate consultata .

II . 1 . 4 . D . Identificare prin CSS a principiilor active

Aparatura:

• Placi cromatrografice din sticla, cu lungimea de 20 cm si latime variabila, pe care se aplica un strat subtire de adsorbant de puritate cromatografica (silicagel) .
• Vase cromatografice din sticla cu posibilitatea de inchidere etansa, de dimensiuni convenabile, pentru a asigura mentinerea placilor in pozitie aproape verticala . ³⁶

Tehnica de lucru: inaintea determinarii se satureaza vasul cromatografic cu amestecul de solventi prevazuti in monografie .

Se traseaza linia de start la o distanta de 2 cm de marginea placii . Distanta dintre doua puncte trebuie sa fie de 1,5 cm .

Solutiile se aplica pe placa cromatografica in benzi cu latimea de 1 cm, daca este cazul solutia se aplica in fractiuni, asteptand evaporarea solventului . Dupa evaporarea solventului, placa cromatografica se introduce in vasul cromatografic cu developant, in pozitie verticala . Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta (10-15 cm), placa cromatografica se scoate, se usuca si se pun in evidenta spoturile . Examinarea spoturilor se face ca atare sau dupa tratare cu reactivi potriviti, in lumina vizibila sau in lumina UV . ³⁶

Identificarea substantelor: se compara valoarea Rf si culoarea sau fluorescenta spoturilor obtinute cu solutia- proba, cu valoarea Rf si culoarea sau fluorescenta spoturilor obtinute cu solutia etalon; cele doua spoturi trebuie sa aiba caracteristici asemanatoare . ³⁶

Rf = a/b

a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare pana la centrul spotului (in cm);

b = distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiei pana la frontul developantului (in cm );³⁶

Identificarea flavonozidelor si ODP-urilor prin CSS

Prin tehnica CSS (cromatografie in strat subtire) se pot separa si identifica, folosind etaloanele corespunzatoare, o serie de heterozide flavonice, agliconii acestora sau acizii polifenolici de tip cafeic si clorogenic . ¹¹

Principiul metodei . Migrarea diferentiata a derivatilor polifenolici pe un strat subtire de silicagel, dintr-o solutie obtinuta cu un solvent selectiv si identificarea spoturilor corespunzatoare cu ajutorul unui agent de clarificare specific . ¹¹

Tehnica de lucru . Pentru analiza heterozidelor flavonice si a acizilor polifenolici se lucreaza in urmatoarele conditii:²⁰

Faza stationara: silicagel Merck, placute cu dimensiuni 10 x 10 cm .

Faza mobila: acetat de etil: apa: acid formic: acid acetic (72 : 14 : 7 : 7) .

Proba : solutie alcoolica 10% ( 1g p . v . + 10 ml metanol se refluxeaza 15 minute pe baia de apa= P₁) .

Substantele de referinta (etaloanele): rutozida, hiperozida, cvercitrozida, apigenin-7-neohesperidozida, luteol-7-glucozida,acid cafeic,acid clorogenic (solutii metanolice 0,1%) .

Cantitatea aplicata la linia de start: 20 μL din solutiile de probe; 10 μL din solutiile de standarde . Spoturile aplicate sunt liniare (in banda), cu latimea de 1 cm .

Distanta de migrare: 12 cm .

Revelator: reactiv NEU/PEG difenil-boril-oxi-etil-amina - solutie metanolica 1% si polietilenglicol - solutie etanolica 5%, pulverizati succesiv), urmat de examinarea placutelor in lumina UV, λ = 365nm . ^11,20

Rezultate

Cromatograma obtinuta la analiza flavonozidelor si a acizilor polifenolici este prezentata in figura nr . 12, iar caracteristicile spoturilor separate in tabelul II .

Figura . Cromatogramele obtinute la analiza prin CSS a flavonozidelor si ODP-urilor din Aristolochie herba ( - examinare in UV 365 nm; 1- T-ra Aristolochie; 2- amestec de ritozida,hiperozida,cvercitozida-s . r; 3-luteol-7-glucozida, s . r; 4-acid cafeic,s . r; 5-acid clorogenic, s . r;)

1 2 3 4 5

Tabelul . (te rog sa il completezi) Caracteristicile spoturilor separate la analiza prin CSS a flavonozidelor si acizilor polifenolici din Aristolochiae herba

Proba analizata contine numerosi compusi cu comportament de flavonozide si acizi polifenolici . Au fost identificate rutozida si luteol-7-glucozida . Nu au fost identificati acizii cafeic si clorogenic (ce spune literatura ?) .

Identificarea prin CSS a compusilor volatili in uleiul volatil de Aristolochia clematitis

Uleiul volatil se obtine prin distilare cu vapori de apa a produsului vegetal Aristolochiae herba .

Principiul metodei are la baza migrarea diferentiata a derivatilor terpenici pe un strat subtire de silicagel . ³⁷

Tehnica de lucru: pentru analiza compusilor volatili din uleiul volatil de la marul-lupului se lucreaza in urmatoarele conditii:

Faza stationara: silicagel G, placute cu dimensiuni 10 x 10 cm .

Faza mobila: toluen:acetat de etil (93:7) .

Proba de analizat: solutie de ulei volatil obtinuta prin diluarea 1 % in clorura de metilen .

Substanta de referinta (etalon): solutie metanolica de borneol 0 . 1 % si solutie α-pinen 0 . 1 % in clorura de metilen ;

Cantitatea aplicata la linia de start: 10 μL solutie de proba si 10 μL solutie de referinta . Spoturile aplicate sunt liniare (in banda), cu latimea de 1 cm .

Distanta de migrare 12 cm .

Revelator : solutie de anisaldehida-sulfurica pulverizata ,apoi placutele se incalzesc la 100 C 5 min si se examineaza in lumina UV si Vis (λ=365 nm) . ³⁷

Rezultate si discutii

In figurilesi se prezinta cromatogramele obtinute la analiza prin CSS a uleiului volatil din Aristolochiae herba (examinare la UV 365 nm)

Tabelul . (te rog sa il completezi) Caracteristicile spoturilor separate la analiza prin CSS a constituentilor uleiului volatil de Aristolochiae herba

In uleiul volatil obtinut din Aristolochiae herba au separat prin tehnica CSS numerosi compusi cu comportament de terpene . Este posibil ca proba analizata sa contina a-pinen . In uleiul volatil nu a fost identificat borneolul .

Concluzie

Prin CSS in uleiul volatil de marul-lupului a fost pusa in evidenta prezenta a numerosi compusi cu comportament de terpena .

Identificarea prin CSS a sterolilor si acizilor triterpenici

Principiul metodei . Migrarea diferentiata a acizilot triterpenici pe un strat subtire de silicagel, dintr-o solutie obtinuta cu un solvent selectiv si identificarea spoturilor corespunzatoare cu ajutorul unui agent de clarificare specific . ¹¹

Tehnica de lucru . Pentru analiza acizilor triterpenici se lucreaza in urmatoarele conditii:²⁰

Faza stationara: silicagel G, placute cu dimensiuni 10 x 10 cm .

Faza mobila : -cloroform:acetona-8:2(v/v) .

Proba de analizat : 1 g p . v se extrag in 10 ml cloroform cu refluxare 15 min,apoi filtrare .

Substantele de referinta : -acid ursolic ,acid oleanolic ,stigmasterol- solutii metanolice 0 . 01 %

Cantitatea aplicata la linia de start: 10 μL solutie de proba si 10 μL solutie de referinta . Spoturile aplicate sunt liniare (in banda), cu latimea de 1 cm .

Distanta de migrare 10 cm .

Revelator : -anhidrida acetica (R) si amestec acid sulfuric conc . :etanol (1:1,v/v) pulverizate succesiv urmat de uscarea placutelor la 100 C timp de 2-3 min si examinarea placutelor in lumina VIS si UV, λ = 365nm .

Rezultate

In figura . . se prezinta cromatograma obtinuta la analiza sterolilor si acizilor triterpenici,iar in tabelul,caracteristicile spoturilor .

1 2 3 1 2 3

Fig . nr . 13 . Cromatograma obtinuta la analiza acizilor triterpenici si stigmasterolului pe solutia cloroformica A - examinare in vizibil; B - examinare in UV 365 nm; 1-proba solutie cloroformica; 2-acid ursolic,stigmasterol,s . r; 3-acid oleanolic,s . r;)

Tabelul . Rezultatele obtinute la analiza prin CSS a acizilor triterpenici pe solutia cloroformica(figura )

Se observa in proba prezenta unui spot cu caracteristici similare substantei de referinta stigmasterol . Nu au separat spoturi cu comportament de acizi triterpenici .

Concluzie: in solutia cloroformica obtinuta din produsul vegetal Aristolochiae herba a fost identificat prin CSS stigmasterolul .

II . 2 . Determinarea puritatii

In terapeutica nu se folosesc produse vegetale degradate, atacate de fungi si insecte, atacate de produse organice de dejectie sau stropite cu substante erbicide si pesticide .

Elementele straine din produsele vegetale pot fi constituite din: parti din aceeasi planta, parti din alte plante (netoxice), produse minerale etc . , care nu trebuie sa depaseasca limitele prevazute in monografia respectiva .

Diferitele elemente straine prevazute in monografia respectiva se preleveaza din proba cu ajutorul unei pensete, se cantaresc separat si rezultatele se raporteaza la 100 g produs vegetal . ³⁶

II . 2 . A . Determinarea impuritatilor din aceeasi planta

Impuritatile din aceeasi planta se refera la parti din planta, nedefinite ca acel produs vegetal (exemplu: fragmente de tulpina pentru produse vegetale de tip folium si flores), sau la produs vegetal degradat .

Tehnica de lucru:

Determinarea cantitativa a impuritatilor din aceeasi planta consta in separarea acestora dintr-o cantitate bine determinata de proba de produs vegetal impur, urmata de cantarirea fractiunilor . Rezultatele se exprima procentual .

Rezultate

Pentru acest produs vegetal nu s-au gasit impuritati din aceeasi planta .

Concluzie

Produsul vegetal studiat este pur din punctul de vedere a prezentei impuritatilor din aceeasi planta .

II . 2 . B . Determinarea corpurilor straine de planta producatoare

Corpurile straine sunt parti ale altor plante cu care specia de interes poate fi confundata involuntar, parti si alte plante de care specia de interes nu poate fi separata in momentul recoltarii sau materii minerale .

Substiuirea accidentala sau voita conduce la anularea eficientei terapeutice sau la aparitia efectelor toxice .

Pentru identificarea elementelor straine se apeleaza la examenul macroscopic . In acest scop, proba de produs vegetal se intinde in strat subtire si se examineaza cu ochiul liber sau cu lupa (6X) . Se observa caracterele anatomice, culoarea, gustul si mirosul si se compara cu cele corespunzatoare produsului vegetal pur .

Determinarea cantitativa a elementelor straine consta in separarea acestora dintr-o cantitate bine determinata de proba de produs vegetal impur, urmata de cantarirea fractiunilor . Rezultatele se exprima procentual . ^11,36

Rezultate

Pentru 50 grame produs vegetal s-au gasit 0,176 g corpuri straine .

Corpuri straine (%)= 0 . 352 %

Concluzie

Produsul vegetal are o puritate foarte avansata, de 99,64% .

II . 3 . Determinarea calitatii

II . 3 . 1 Determinari preliminarii

II . 3 . 1 . A . Determinarea umiditatii

Umiditatea se refera la cantitatea de apa ramasa in produsul vegetal dupa uscare (apa de constitutie) .

Acest parametru este influentat de mediul ambiant si are legatura directa cu conservabilitatea produsului . Excesul de umezeala poate favoriza dezvoltarea unor microorganisme sau poate activa o serie de sisteme enzimatice, care conduc la formarea unor produsi mai putin activi .

Limitele admise se exprima in grame si se calculeaza procentual .

Determinarea se face in fiole de cantarire al caror diametru se alege astfel incat proba luata in lucru sa formeze un strat de 5 mm grosime . Fiola de cantarire se aduce la masa constanta in aceleasi conditii in care urmeaza sa se faca determinarea . Proba luata in lucru se pulverizeaza, se uniformizeaza prin amestecare si se cantareste la balanta analitica .

Tehnica de lucru: fiola de cantarire cu proba luata in lucru se mentine la etuva, la 105 ⁰C, timp de 3-4 ore, se raceste la exicator si se cantareste . Se continua uscarea pana la masa constanta . ³⁶

Formula de calcul pentru determinarea umiditatii este urmatoarea:

U%=100- x 100

U%= umiditatea produsului vegetal (%)

M₁= masa fiola de cantarire cu produs vegetal umed (in grame)

M₂= masa fiola cu produs vegetal uscat (in grame)

M₀= tara fiola de cantarire (in grame)¹¹

Observatii: Produsul vegetal contine si ulei volatil, de aceea vorbim nu numai de umiditate, ci de pierderi prin uscare .

Rezultate si discutii

Valorile obtinute la determinarea umiditatii produsului vegetal Aristolochiae herba sunt redate in tabelul .

Tabelul . Valorile obtinute la determinarea umiditatii produsului vegetal Aristolochiae herba

U%_mediu= 6 . 60%

Produsul vegetal are o umiditate medie de 6,60%, valoare care se incadreaza in limitele maxime de admisibilitate pentru herba (maxim 12 - 13 %) [] . Umiditatea scazuta este o garantie a unei bune conservabilitati a acestui produs vegetal .

Concluzie

Produsul vegetal are o umiditate medie de 6,60% .

II . 3 . 2 . Determinarea cantitatii de principii active

II . 3 . 2 . A . Dozarea flavonelor

Dozarea se realizeaza printr-o metoda spectrofotometrica .

Principiul metodei: flavonozidele formeaza cu clorura de aluminiu, chelati de culoare galbena (bibliografie) .

Tehnica de lucru: 1 g produs vegetal se extrage cu metanol intr-un aparat de extractie continua, pana la epuizarea produsului vegetal . Solutia extractiva se filtreaza intr-un balon cotat de 100 ml si se completeaza la semn cu metanol 50% (solutia A) . Din aceasta solutie se pipeteaza 2 probe ce corespund la 2 martori . Prima proba este de 0 . 7 ml ,iar a doua de 1 ml ,luati din solutia A . Peste cele 2 probe se aduc cate 1 ml acetat de Na 10 %,o . 6 ml clorura de aluminiu 2 . 5 % si metanol 50 % pana la semn . Peste martorii corespunzatori de 0 . 7 si 1 ml se aduce metanol 50 % pana la semn (b . c de 10 ml) . Se lasa in repaus 45 minute .

Se citesc extinctiile probelor de analizat fata de martorii respectivi la un spectofotometru, la lungimea de unda de 427 nm . ^11,36

Obtinerea curbei etalon de rutozida

Curba de calibrare a rutozidei,realizata in intervalul de concentratii 1-4 µg/mL este prezentata in fig .

Ecuatia acestei curbe este :

Y=0 . 0045+0,2216x

Unde citite y = absorbanta probei,iar x = concentratia corespunzatoare absorbantei citite (µg/mL) . Coeficientul r = 0,999918 .

Concentratia de flavonozide, exprimata in rutozida, se calculeaza dupa formula:

C%

c % = concentratia de flavonozide a probei (µg rutozid/100 g p . v uscat);

Ep = absorbanta probei;

Eet = absorbanta solutiei de rutozid de concentratie Cet din curba etalon;

Cet = concentratia solutiei de rutozida rezultata din curba etalon (µg/mL);

Cp = masa de produs vegetal uscat corespunzatoare la 1 mL solutie proba falosita la dozare (g/mL)

Rezultate

Valorile curbei etalon de rutozida sunt redate in tabelul VIII .

Tabel VIII . Valorile concentratiilor si absorbantelor din curba etalon rutozida

0 . 5058 g p . v cu U=6 . 60%

100 g p . v 93 . 40 g p . v uscat

0 . 5058 ga

a=0 . 4724 g p . v uscat

Ep₁=0 . 317 E1 =0 . 144 (?) atentie la valorile E_p!

Ep₂=0,317 E2=0 . 185

C % = 0,300 - 0,317 g % .

Valoarea obtinuta la dozarea flavonozidelor este relativ mare, raportat la continutul in flavonozide al altor produse vegetale (exemple, bibliografie) . Studiul efectuat anterior (lucrare de diploma, 2007) pe acelasi produs vegetal, dar de alta provenienta a condus la valoarea de 0,011 g % flavonozide (exprimate in rutozida) .

Concluzie

Produsul vegetal contine 0,300g % - 0,317g % flavonozide (exprimate in rutozida) .

II . 3 . 2 . B . Dozare O . D . P . -uri

Dozarea se realizeaza printr-o metoda spectofotometrica .

Principiul metodei: determinarea intensitatii coloratiei rosii a oximei acidului cafeic, obtinuta in urma reactiei cu reactivul Arnow (bibliografie) .

Tehnica de lucru: 1 g produs vegetal se extrage cu metanol intr-un aparat de extractie continua, pana la epuizarea produsului vegetal . Solutia extractiva se filtreaza intr-un balon cotat de 100 ml si se completeaza la semn cu metanol 50%(solutia A) . 1ml solutie A se aduce intr-un blon cotat de 10 ml, se adauga 2 ml HCl 0,5 N, 2 ml reacriv Arnow si 2 ml NaOH 10% . Se completeaza la semn cu metanol 50% si se citeste extinctia, imediat, la 525 nm, in cuve de 1 cm . Citirea se face fata de proba martor, obtinuta in aceleasi conditii, dar in care nu se mai adauga reactiv Arnow . ³⁷

Cantitatea de ODP-uri exprimata in acid clorogenic corespunzator la 100 g produs vegetal se calculeaza conform formulei:

C%

C% = concentratie ODP-uri (g% acid clorogenic)

A = absorbanta probei .

m= masa in grame a produsului vegetal, uscat, luata in lucru . ³⁷

Rezultate:

a= 0,4724 g p . v uscat

A=0 . 243

C%=2 . 72 g %

Produsul vegetal are un continut ridicat de acizi polifenolici () .

Studiul efectuat anterior (lucrare de diploma, 2007) pe acelasi produs vegetal, dar de alta provenienta a condus la valoarea de 2,59 g % acizi polifenolici (exprimati in acid cafeic) .

Concluzie

Produsul vegetal contine 2 . 72 % ODP-uri (exprimate in acid clorogenic) .

II . 3 . 2 . D . Dozarea uleiurilor volatile

Dozarea uleiurilor volatile din produsele vegetale se efectueaza prin distilare cu vapori de apa .

Tehnica de lucru: masa produsului vegetal pulverizat si volumul de apa prevazut se introduc intr-un balon, care se adapteaza la un dispozitiv de distilare . Tubul gradat in diviziuni de 0,01ml si partea inferioara a separatorului se umplu cu apa printr-un tub care se inchide apoi cu un dop strabatut de un canal . Se lasa sa circule apa printr-un refrigerent si se incalzeste balonul, astfel incat apa sa fiarba si sa distileze cu o viteza moderata . Dupa terminarea distilarii, se opreste circuitul apei din refrigerent si se lasa sa circule vaporii timp de cateva minute pentru a spala refrigerentul de urmele de ulei aderent . Cand refrigerentul s-a incalzit pe toata lungimea sa, se lasa sa circule din nou apa si se opreste sursa de caldura . Dupa 30 minute se coboara incet stratul de ulei in tubul gradat, prin deschiderea robinetului . Se citeste volumul de ulei in mililitri si se raporteaza la 100 g produs vegetal . ³⁶

Rezultate si discutii

Produsul vegetal Aristolochiae herba are un continut foarte scazut de ulei volatil, de 0,01 mL/ 100 g produs vegetal . In literatura de specialitate consultata nu am gasit date privind continutul de ulei volatil al acestui produs vegetal .

Concluzii

Produsul vegetal Aristolochiae herba contine 0,01 mL ulei volatil/ 100 g produs vegetal .

STUDII FITOCHIMICE EFECTUATE ASUPRA TINCTURII 1:10 OBTINUTE DIN PRODUSUL VEGETAL ARISTOLOCHIAE HERBA

Produsul din comert sub denumirea de REMF tinctura din plante medicinale ,are un prospect atasat in care se precizeaza compozitia dar fara cantitatile exacte,actiunea terapeutica ,mod de administrare,contraindicatii si precautii . Am incercat sa compar tinctura aceasta cu T-ra proprie .

Prepararea tincturii 1:10 din produsul vegetal Aristolochie herba

Peste 10 g produs vegetal adus la gradul de maruntire corespunzator se adauga 100 g alcool 70 ° preparat anterior din alcool 90° si apa,intr-un vas inchis . Se tine la temperatura camerei timp de 10 zile agitand de 3-4 ori pe zi . Lichidul extractiv se decanteaza si reziduul se preseaza . Lichidele extractive reunite si omogenizate se lasa sa sedimenteze la 5-10 °C timp de 6 zile si se filtreaza evitand pierderile prin evaporare .

Identificarea prin reactii specifice a unor principii active prezente in tinctura de Aristolochie herba

Identificare flavone

Principiul metodei si tehnica de lucru au fost prezentate in cap . .

Rezultate: reactii pozitive;

Concluzie : T-ra contine flavone .

Identificare acizi polifenolici

Principiul metodei si tehnica de lucru au fost prezentate in cap . .

Rezultate: reactii pozitive;

Concluzie : T-ra contine acizi polifenolici .

Identificare sterolilor si acizi triterpenici

Principiul metodei si tehnica de lucru au fost prezentate in cap . .

Concluzie : T-ra contine steroli si acizi triterpenici

Identificarea flavonozidelor si ODP-urilor in T-ra Aristolochiae proprie si T-ra Remf comert

Principiul metodei . Migrarea diferentiata a componentelor pe un strat subtire de silicagel, dintr-o solutie obtinuta cu un solvent selectiv si identificarea spoturilor corespunzatoare cu ajutorul unui agent de clarificare specific . ¹¹

Tehnica de lucru . Pentru analiza acidului aristolohic se lucreaza in urmatoarele conditii:²⁰

Faza stationara: silicagel G, placute cu dimensiuni 10 x 10 cm .

Faza mobila : -acetat de etil:apa:acid formic:acid acetic(72:14:7:7) .

Proba de analizat : solutie alcoolica de Aristolochie herba .

Substantele de referinta : -rutozida,luteol-7-glucozida .

Cantitatea aplicata la linia de start: 20 μL solutie de proba si 10 μL solutie de referinta . Spoturile aplicate sunt liniare (in banda), cu latimea de 1 cm .

Distanta de migrare 12 cm .

Revelator : reactiv NEU/PEG (difenil-boril-oxi-etil-amina-solutie metanolica 1 % si PEG 400-solutie etanolica 5 %,pulverizati succesiv),urnat de examinarea placutelor in lumina UV,λ= 365 nm .

Rezultate

Cromatograma obtinuta la analiza flavonelor este prezenta in figura nr . 14, iar caracteristicile spoturilor separate, in tabelul IV .

Figura . Cromatogramele obtinute la analiza prin CSS a flavonozidelor din T-ra Aristolochie si T-ra Remf comert ( - examinare in UV 365 nm; 1- T-ra Aristolochie; 2- T-ra Remf; 3-rutozida s . r; 4-luteol-7-glucozida,s . r;)

Tabelul . Rezultatele obtinute la analiza prin Css a flavonozidelor din T-ra Aristolochiae herba si T-ra Remf .

Concluzii

Identificare de ODP-uri si cumarine prin CSS, in cele 2 tincturi

Principiul metodei . Migrarea diferentiata a componentelor pe un strat subtire de silicagel, dintr-o solutie obtinuta cu un solvent selectiv si identificarea spoturilor corespunzatoare cu ajutorul unui agent de clarificare specific . ¹¹

Tehnica de lucru . Pentru analiza ODP-urilor si cumarinelor se lucreaza in urmatoarele conditii:²⁰

Faza stationara: silicagel G, placute cu dimensiuni 10 x 10 cm activate la 110°C ,30 minute .

Faza mobila : -acetat de etil:metanol:apa(100:16 . 5:13 . 5) .

Proba de analizat : T-ra Aristolochiae herba si T-ra Remf

Substantele de referinta : -acid cafeic,acid clorogenic,esculetina .

Cantitatea aplicata la linia de start: 20 μL solutie de proba si 10 μL solutie de referinta . Spoturile aplicate sunt liniare (in banda), cu latimea de 1 cm .

Distanta de migrare 12 . 5 cm .

Revelator : - lumina VIS si UV, λ = 365n

Rezultate

Cromatograma obtinuta la analiza aciduui aristolohic este prezenta in figura nr . 14, iar caracteristicile spoturilor separate, in tabelul IV .

Figura . . Cromatograma obtinuta la analiza ODP-urilor si cumarinelor din T-ra Aristolochie siT-ra remf (A-examinare in UV 365 nm ;1 - T-ra REMF comert, 2 - T-ra Aristolochie ; 3-acid cafeic s . r; 4-acid clorogenics . r; 5-esculetina s . r;)

Tabelul . Rezultatele obtinute la analiza prin CSS a ODP-urilor si cumarinelor din T-ra Aristolochie si T-ra Remf (figura . . )

Concluzii

Identificarea prin CSS a acidului aristolochic in tinctura obtinuta in laborator si in preparatul comercial .

Principiul metodei . Migrarea diferentiata a componentelor pe un strat subtire de silicagel, dintr-o solutie obtinuta cu un solvent selectiv si identificarea spoturilor corespunzatoare cu ajutorul unui agent de clarificare specific . ¹¹

Tehnica de lucru . Pentru analiza acidului aristolohic se lucreaza in urmatoarele conditii:²⁰

Faza stationara: silicagel G, placute cu dimensiuni 10 x 10 cm activate la 110°C ,30 minute .

Faza mobila : -acetat de etil:metanol:apa(100:16 . 5:13 . 5) .

Proba de analizat : solutie alcoolica de Aristolochie herba .

Substantele de referinta : -acid aristolohic solutie metanolica 0 . 1 % .

Cantitatea aplicata la linia de start: 20 μL solutie de proba si 10 μL solutie de referinta . Spoturile aplicate sunt liniare (in banda), cu latimea de 1 cm .

Distanta de migrare 10 cm .

Revelator : - lumina VIS si UV, λ = 365nm .

Rezultate

Cromatograma obtinuta la analiza aciduui aristolohic este prezenta in figura nr . 14, iar caracteristicile spoturilor separate, in tabelul IV .

Rezultate

Tabel . . Caracteristicile spoturilor separate la analiza prin CSS a acidului aristolochic, in tinctura obtinuta din Aristolochiae herba si in produsul comercial REMF

Concluzii

Proba analizata contine numerosi compusi cu comportament de flavonozide . A fost identificat acidul aristolochic . (ce spune literatura ?) .

IV . Concluzii generale

In urma studiului farmacognostic la care a fost supus produsul vegetal Aristolochie herba s-au observat urmatoarele:

Din punct de vedere macroscopic, s-au putut evidentia caracteristicile principale ale produsului vegetal, care corespund descrierilor din literatura de specialitate .

Din punct de vedere microscopic, produsul vegetal se incadreaza in descrierile din literatura de specialitate . Au fost identificate principalele caractere microscopice atat cele comune tuturor produselor vegetale de tip flores (fragmente de endoteciu, papile, grauncioare de polen, fragmente de epiderma, vase de lemn de calibru mic), cat si elemente specifice produsului vegetal Aristolochie herba ( grauncioare de polen cu sase pori germinativi, papile, vase de lemn spiralate, ) .

In urma examenului microchimic s-a putut evidentia prezenta cumarinelor mentionate in literatura .

In cadrul analizei chimice calitative au fost puse in evidenta principalele grupe de constituenti chimici ai produsului vegetal . Au fost identificate in solutie extractiva eterica, alcoolica cat si apoasa urmatoarele clase de compusi: oze, acizi polifenol carboxilici, flavonozide, cumarine, taninuri catehice, saponozide sterolice (in solutiile extractive apoase si alcoolice), steroli (in solutia eterica), carotenoide si alcaloizi . In produsul vegetal nu s-a putut pune in evidenta prezenta rezinelor, mentionate in literatura consultata .

In urma analizei prin C . S . S . a solutiei extractive alcoolice s-a putut evidentia prezenta acidului aristolochic, flavonozidelor, a acidului cafeic, iar pe solutia cloroformica s-au identificat stigmasterolul . Tot prin C . S . S . s-a observat prezenta α-pinenului si a numerosi compusi cu comportament de terpena in uleiul volatil extras din Aristolochie herba,insa nu a fost identificat borneolul .

Din punct de vedere a puritatii, produsul vegetal corespunde normelor de calitate, avand o puritate de 99 . 64% .

Umiditatea este de 6 . 60%, incadrandu-se in limitele maxime admise .

Continutul de flavonozide din produsul vegetal este de 0,300-0 . 317 g % (exprimare in rutozida), iar cel de acizi polifenolici este de 2 . 72 g% (exprimare in acid clorogenic) . Continutul de flavonozide si de acizi polifenolici al produsului vegetal supus analizei este relativ crescut .

Din punct de vedere a continutului in ulei volatil ,in urma determinarilor efectuate s-au obtinut practic 0,1 ml/100g p . v . Acest continut in ulei volatil mult mai mic decat cel prevazut demonstreaza ca recoltarea si depozitarea nu s-au facut conform prevederilor din literatura de specialitate .

Concluzie finala: Produsul vegetal analizat farmacognostic corespunde din punct de vedere macroscopic, microscopic si chimic calitativ cu prevederile din literatura de specialitate .

V . CORELATII INTRE PRINCIPIILE ACTIVE IDENTIFICATE IN PRODUSUL VEGETAL SI ACTIUNEA SA TERAPEUTICA

Grupele de principii active pe care le-am identificat in produsul vegetal Aristolochie herba sunt:

- oze;

- cumarine;

- acizi polifenolici;

- flavonozide;

- tanin;

- carotenoide;

- steroli;

-alcaloizi (acidul aristolohic);

- ulei volatil .

Prezenta acestor principii active in produsul vegetal ar putea justifica o serie de actiuni terapeutice, mentionate si de catre producator, astfel:

- actiunea diuretica se explica prin prezenta flavonozidelor cat si sterolilor;

- actiunea coleretica este imprimata de acizii polifenolici de tip acid cafeic si derivati;

-actiunea antiseptica si cicatrizanta se datoreaza prezentei in cantitate mare a taninurilor cat si sterolilor; administrate intern, taninurile au actiune antiseptica ca urmare a precipitarii proteinelor bacteriene si fungice;pe cale externa (aplicari locale) impermeabilizeaza straturile superficiale ale pielii si mucoaselor, protejand astfel straturile subadiacente si grabind cicatrizarea, proces la care contribuie si efectul antiseptic; limitand pierderile de lichide si oprind agresiunile exterioare, favorizeaza regenerarea tesuturilor in caz de leziuni superficiale sau de arsuri; de subliniat insa, ca taninurile, administrate intern in cantitate mare au potential hepatotoxic si cancerigen;

-stimuleaza epitelizarea datorita fitocomplexului format din tanin,flavonozide,alantoina,steroli si acid aristolohic;

-actiune imunostimulatoare datorata acidului aristolochic care creste productia de limfokine ,activeaza metabolismul si fagocitoza;

- actiune spasmolitica datorata actiunii acidului aristolohic;

-scade timpul de sangerare probabil datorita actiunii flavonozidelor;

-actiune antivirala datorita acidului aristolohic,sterolilor cat si flavonelor continute .

Datorita continutului in acid aristolohic cat si altor alcaloizi planta este toxica,desi producatorul mentioneaza o serie de afectiuni care necesita administrarea interna a T-rii .

Vezi daca informatiile de pe prospect privind actiunea terapeutica s-ar putea explica prin prezenta principiilor active pe care tu le-ai identificat . Ultima fraza trebuie sa scoata in evidenta faptul ca produsul vegetal este toxic prin continutul in alcaloizi si acid aristolochic . La fel produsul comercial analizat . Cred ca trebuie reformulat ce e scris cu verde . Incearca tu sa scrii ceva . Eu voi corecta .

Cumarinele scad permeabilitatea capilara si cresc debitul limfatic si venos, au actiune venotona si vasoprotectoare, bacteriostatica (umbeliferona), ecrananta impotriva radiatiilor solare (cumarina si derivatii)¹⁷ . Produsul vegetal Aristochia herbae contine cumarine deci se poate folosi pentru actiunile imprimate de acestea

. Produsul vegetal Aristolochia clematitis contine steroli si poate fi utilizat pentru actiunile date de acestia⁷

. Flavonele prezinta numeroase actiuni si intrebuintari printre care cele mai importante sunt: rol de factor P (cresc rezistenta vaselor capilare si scad permeabilitatea acestora), antioxidanta, diuretica, antivirala, antifungica, scad timpul de sangerare si in functie de compusii constituiti, actiuni proprii acestora (antiinflamatoare prin apigenol, crisol, taxifolol; antiulceroasa prin kemferol; hepatoprotectoare prin silimarina, silicristina, silidianina etc . )¹⁷ .

Carotenoidele prezinta actiune stomahica, carminativa, excitanta SNC, emenagoga¹⁸, imprimand si produsului vegetal Aristolochiae herbae aceleasi actiuni .

Saponozidele prezinta actiune expectoranta, antiinflamatoare, cicatrizanta, diuretica, vasoprotectoare, antimicrobiana, antimicotica, antivirala, adaptogena . ¹⁷

Anexa 1

5g p . v . + 50ml eter, macerare 24h

Extract eteric p . v .

2-3ml + 1ml+ 2-3 ml+ 2-3ml+ 2-3ml+ 2-3ml+

reziduu 1ml NaOH10% reziduu reziduu reziduu 0,5ml acetat

+ 4ml +2ml H₂O + (CH₃CO)₂O de cupru

C₂H₅OH 70% Emodoli calda + H₂SO_4conc

+R . Carr-Price

1ml+ 1ml+

NaOH 10% apa Steroli, triterpene

Carotenoide

UV

Agl . cumarinici

M 1ml+ 1ml+ 1ml+ Mg

NaOH 10% AlCl₃ HCl_conc

Agl . Flavonici

5g p . v . +50ml apa, t^oC, 15 minute

25 ml sol apoasa M 25ml sol apoasa (A)

1ml sol+ 6ml sol, se conc 1ml sol, agitare 1ml sol+FeCl₃

Fehling

2ml sol se ad . peste Spuma persistenta Id . Tanin 1ml 1ml 1ml

+10ml acetona + NaOH +AlCl₃ +Mg/HCl Id . Saponozide Id . Oze

Id . Mucilagii

Id . Flavone

(A): 25 ml sol apoasa + 15 ml HCl, t^oC, racire

Sol extr . hidrolizata

M₁ > M viraj de culoare + eter (p . s . ) sol eterica reziduu

+ CH₃OH

Id . Proantociani Id . Agliconi Flavonici

Id . Antocianozide

BIBLIOGRAFIE

Ciulei I . , Istudor V . , Palade M . , Albulescu D . , Gird C . E . - Analiza farmacognostica si fitochimica a produselor vegetale, Ed . Tehnoplast Company S . R . L . , Bucuresti, 1995, vol . I

Gird C . E . , Dutu L . E . , Popescu M . L . , Pavel M . -Farmacognozie -baze practice, Ed . Universitara Carol Davila, Bucuresti, 2005, vol . I

Gird C . E . , Dutu L . E . , Popescu M . L . , Pavel M . -Farmacognozie -baze practice, Ed . Universitara Carol Davila, Bucuresti, 2006, vol . II

Farmacopeea Romana editia a X-a, Ed . Medicala, Bucuresti, 1993

https://ro . wikipedia . org