Separarea aminoacizilor dintr-un amestec prin cromatografia pe hartie

Separarea aminoacizilor dintr-un amestec prin cromatografia pe hartie

1.Consideratii generale

Aminoacizii reprezinta unitatile chimice de baza care intra in alcatuirea structurii protidelor. Desi in natura se cunosc aproximativ 200 de aminoacizi, organismele utilizeaza un nr. restrans pentru biosinteza diferitelor tipuri de protide, aproximativ 20-22 de aminoacizi.

Toti aminoacizii prezinta ca trasatura comuna existenta unei functii amina primara(-NH2) si a unei functii carboxil (-COOH), ambele grefate la acelasi atom de carbon, denumit -a

Aminoacizi sunt substante amfotere, in solutie comportandu-se ca amfiioni, datorita disocierii gruparilor functionale carboxil si amina. Datorita caracterului lor amfoter, aminoacizii se comporta in mediu acid ca baze, disociind sub forma de cationi, iar in mediu bazic ca acizi, disociind sub forma de anioni.

Principiu:

Deoarece proteinele sunt alcatuite dintr-un amestec de diferiti aminoacizi in proportii diferite care caracterizeaza proteina respectiva, este important a cunoaste aminoacizii constituenti.

Separarea si identificarea aminoacizilor constituenti este posibila prin cromatografierea pe hartie a hidrolizatului proteic.

In cromatografia pe hartie - care este o metoda de repartitie, se foloseste hartie de filtru imbibata si strabatuta de diferite amestecuri de solventi, de exemplu fenol - apa sau butanol - apa. Acestia determina aminoacizii adsorbiti de marginea de jos a hartiei de filtru sa se deplaseze de-a lungul ei cu viteze diferite, caracteristice fiecarui aminoacid, ocupand astfel pozitii diferite pe cromatograma. Deoarece aminoacizii sunt incolori, cromatograma necesita o reactie de culoare cu ninhidrina. Aminoacizii se prezinta in cromatograma sub forma de pete de dimensiuni diferite, cu intensitati diferite de culoare.

Pentru identificarea fiecaruia in parte se face o cromatograma de comparatie, folosind cate un aminoacid cunoscut, astfel se poate cunoaste pozitia fiecarui aminoacid in cromatograma.

Intrucat separarea si identificarea aminoacizilor din hidrolizate proteice necesita insusirea unei tehnici speciale, in lucrarea practica se vor separa amestecuri simple de aminoacizi cunoscuti.

Experienta Substante necesare:

amestec de 2 - 3 aminoacizi (1 mg / l ap 0,1%)

solutii de control de aminoacizi (1 mg/l)

amestec de developare butanol - acid acetic - apa 4:1:5

ninhidrina (0,1 - 0,2% in butanol)

hartie cromatografica Whatman nr. 1 (5/10 cm)

Mod de lucru:

Pe o fasie de hartie de filtru se trage cu creionul o linie paralela cu unul din capete la o distanta de 2 cm de marginea hartiei.

Pe aceasta linie (linia de start) se aseaza cu o micropipeta cate o picatura din solutia de cercetat si din solutiile de control, din loc in loc, la circa 2 cm interval, notandu-se in prealabil locul fiecarei substante. Diametrul picaturilor trebuie sa fie de 2 - 3 mm, iar cantitatea maxima de aminoacizi intr-o pata injur de 0,03 mg. Hartia cu petele uscate in prealabil se introduce in camera de cromatografiere care contine un strat de amestec de developare de 2 - 3 mm grosime, astfel incat capatul pe care au fost pusi aminoacizii sa ajunga in acesta. Petele de aminoacizi nu trebuie sa intre in amestecul de developare. Se lasa un timp, pana cand frontul solventului ajunge la 2 cm de la marginea superioara a hartiei (developare ascendenta). Se scoate hartia, se noteaza cu creionul frontul solventului, se usuca in etuva la 1000C si se pulverizeaza cu ninhidrina. Se introduce 10 minute in etuva la 900C, apoi se observa pozitia si intensitatea culorii petelor aparute si se calculeaza Rf. Prin pulverizare cu o solutie de NiSO4 4% se pot proteja de decolorare cromatogramele revelate cu ninhidrina.

Rf = distanta de la linia de start pana la pata

distanta de la linia de start - front solvent

Valorile Rf ale catorva aminoacizi in conditiile experientei:

triptofan 0,43 arginina 0,10

alanina 0,24 histidina 0,10

acid glutamic 0,17 fenilalanina 0,53

cisteina 0,08 leucina 0,61

glicocol 0,17