CULTIVAREA BACTERIILOR

1.1      NOTIUNI GENERALE

Cultivarea microorganismelor “in vitro” reprezinta o etapa esentiala pentru clarificarea diagnosticului etiologic al unei infectii si are aplicatii largi in activitati industriale, semiindustriale si in cercetarea stiintifica fundamentala.

In laborator, cultivarea majoritatii bacteriilor patogene este posibila prin insamantarea pe medii de cultura acelulare. Mult mai rar, pentru unii germeni, obligatoriu intracelulari, se pot folosi sisteme biologice vii (culturi celulare, oua embrionate, animale de laborator). Pentru a putea lua in discutie, in mod corect, cultivarea bacteriilor, este necesara cunoasterea unor termeni care fac parte din limbajul specific al microbiologiei.

Mediile de cultura sunt substraturi solide, semisolide sau lichide ce pot asigura substantele plastice si energetice necesare cresterii si multiplicarii bacteriilor in laborator.

In bacteriologie, prin termenul de insamantare este definita manevra de depunere a unei cantitati de germeni in interiorul sau pe suprafata unui mediu acelular.

Inocularea este operatiunea de introducere a unei cantitati de germeni intr-un sistem biologic viu.

O cultura bacteriana este alcatuita din toate bacteriile ce cresc in interiorul sau pe suprafata unui mediu de cultura.

Coloniile bacteriene sunt formatiuni de diverse forme si dimensiuni care pot fi vazute cu ochiul liber pe suprafata unui mediu de cultura solid. Fiecare colonie reprezinta o clona.

Clona este o populatie bacteriana formata din indivizi cu un bagaj genetic identic, proveniti dintr-un stramos comun.

O cultura monobacteriana (pura) contine un singur tip de colonii, corespunzatoare cresterii unei specii bacteriene.

O cultura este pluribacteriana (mixta) atunci cand aceasta  este alcatuita din mai multe tipuri de colonii, corespunzatoare unor specii diferite.

Termenul de inocul se refera la o suspensie microbiana, cu o anumita concentratie (germeni ml), preparata, de obicei, prin introducerea, in laborator, a unei cantitati definite de  germeni intr-un lichid steril (bulion de carne, ser fiziologic, etc.) care este insamantata pe suprafata sau in interiorul unui mediu acelular sau introdusa intr-un sistem biologic

Dispersia inoculului reprezinta operatiunea de diseminare a produsului de insamantat, cu o ansa-bucla, prin miscari de zig-zag, intr-un strat cat mai subtire, pe suprafata unui mediu de cultura solid, in scopul obtinerii unor colonii bacteriene izolate, necesare pentru identificarea de gen sau de specie si pentru testarea comportamentului fata de antibiotice.

Cresterea este procesul de marire coordonata a structurilor bacteriene prin sinteza de noi molecule identice care se poate produce atata timp cat raportul intre suprafata si volumul celulei este supraunitar.

Multiplicarea bacteriilor reprezinta procesul de diviziune a celulei bacteriene care succede cresterii acesteia permitand restabilirea unui raport intre suprafata si volum favorabil schimburilor intense cu mediul extern.

1.2      CONDITII NECESARE DEZVOLTARII BACTERIENE

In vitro, germenii necesita, pentru dezvoltare si multiplicare, anumite conditii fizico-chimice:

Temperatura

In functie de variatiile de temperatura pe care le tolereaza, bacteriile se clasifica in:

Bacterii stenotermale: necesita o temperatura relativ constanta;

Bacterii eurytermale: pot suporta variatii largi de temperatura.

In raport cu temperatura optima, se disting:

Bacterii criofile (lb gr.: crios = inghetat) sau psihrofile (lb. gr.: psikhros = frig temperatura optima = 10-15 C; traiesc in zonele reci ale globului reprezentand si cauza degradarii alimentelor sau medicamentelor pastrate in frigidere; unele sunt conditionat patogene;

Bacterii mezofile: temperatura optima = 30-37 C; sunt cele mai raspandite, libere sau in organismul unei gazde; sunt implicate in diverse infectii ale omului sau animalelor cu sange cald;

Bacterii termofile: temperatura optima = 50-60 C; se gasesc in zonele calde, puternic expuse la soare, ape termale sau de incalzire; sunt nepatogene.

Pe masura apropierii de temperatura minima a intervalului tolerat, metabolismul bacterian incetineste si timpul de generatie se prelungeste treptat pana la un punct critic cand multiplicarea inceteaza. In schimb, spre temperatura maxima, metabolismul este accelerat aparand alterari ale celulei bacteriene. Temperatura optima reprezinta valoarea termica la care dezvoltarea bacteriana este cea mai activa.

Umiditatea

Daca nu este asigurata umiditatea necesara a mediului de cultura, dezvoltarea bacteriilor inceteaza.

pH-ul

Majoritatea bacteriilor prefera valorile pH-ului (termen generic dat logaritmului cu semn schimbat al concentratiei de H dintr-o solutie ce indica gradul de aciditate sau alcalinitate al acesteia) din zona neutralitatii (7,2-7,6). Sunt si specii care se dezvolta numai in medii acide (ex.: genul Lactobacillus) sau alcaline (ex.:genul Vibrio). Bacteriile care necesita un pH acid pentru dezvoltarea lor se numesc acidofile.

Presiunea osmotica

Majoritatea bacteriilor sunt osmotolerante (pot suporta variatii largi ale presiunii osmotice). Au fost descrise si specii halofile (necesita concentratii mari de clorura de sodiu – ex.: Vibrio parahaemolyticus) sau halotolerante (tolereaza concentratii mari de NaCl – ex.: stafilococii).

Conditii necesare unor categorii de bacterii

In acest context, pot fi mentionate absenta sau prezenta si concentratia oxigenului (bacterii aerobe, anaerobe, microaerofile, etc.), intunericul (unele bacterii chimiosintetizante), atmosfera de 5-8 % dioxid de carbon (bacteriile pretentioase), etc..

1.3      CARACTERE DE CULTURA

Caracterele culturale ale bacteriilor se caracterizeaza printr-o mare variabilitate existand posibilitatea ca modalitatile de crestere bacteriana pe in interiorul unui mediu acelular sa fie diferite chiar in cazul unor bacterii din aceeasi specie.

Astfel, pe mediile solide, in functie de natura acestora, de conditiile de incubare, de specie si de virulenta tulpinii, bacteriile adopta mai frecvent urmatoarele forme:

colonia S (limba engleza: smooth = neted) – reprezinta, in general, modul de crestere al tulpinilor bacteriene virulente (care au capacitate de sinteza a structurilor speciale din stratul superficial al peretelui bacterian); este lucioasa, bombata, putin aderenta, rotunda, cu suprafata neteda, margini regulate si o consistenta cremoasa sau apoasa;

colonia R (limba engleza: rough = aspru) – in mod obisnuit, este caracteristica tulpinilor bacteriene in-vechite, nevirulente; este mata, plata, aderenta, de forma neregulata, cu suprafata rugoasa, zbarcita, cu margini dintate, uscata.

Exista exceptii precum speciile Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis si Bacillus anthracis, la care tulpinile virulente cresc sub forma R.

In afara acestor forme de crestere, se mai pot descrie

colonia M (mucoida) - corespunde unor specii inalt virulente, capabile sa formeze capsule de grosimi mari (ex.: Klebsiella pneumoniae); are dimensiuni mai crescute, este stralucitoare, rotunda, bine delimitata, bombata, cu suprafata neteda, consistenta mucoida si tendinta de confluare;

colonia G (pitica) - reprezinta forma de crestere pe medii solide a unor germeni care in mod normal formeaza colonii mari dar in urma actiunii unor substante antimicrobiene si-au pierdut din virulenta; este punctiforma, transparenta.

In medii lichide, semnele de crestere ale acestor forme bacteriene sunt, de asemenea, distincte. Astfel:

forma S - tulbura omogen mediul;

forma R - formeaza depozit grunjos la fundul tubului.

Factorii care determina variatia de forma de crestere sunt calitatile acestora (potentialul nutritiv, umiditatea, pH-ul), specia, conditiile de incubare (temperatura, umiditate, timp), varsta culturii sau prezenta unor inductori (antibiotice, bacteriofagi).

1.4      DINAMICA CRESTERII BACTERIENE

In conditii de laborator, cultivarea bacteriilor se realizeaza intr-un volum de mediu limitat, deci culturile sunt discontinue.

Aprecierea unei culturi bacteriene poate fi calitativa sau cantitativa. In primul caz, se pot observa cu ochiul liber carac-terele de cultura. In al doilea caz, determinarea numarului de bacterii/ml de cultura se poate realiza prin metode colorimetrice sau prin metoda dilutiilor.

Cresterea bacteriilor (in volum – dupa o ratie cubica, in suprafata – dupa o ratie patratica) in vitro este limitata de aportul de nutrienti si de acumularea de metaboliti rezultati din procesele catabolice.

Atunci cand raportul intre suprafata si volum devine subunitar, cresterea inceteaza si bacteriile incep sa se multiplice.

Dinamica cresterii si multiplicarii unei populatii bacteriene in vitro a fost reprezentata printr-o curba cu 6 portiuni:

q        faza de latenta (numita si faza de lag de la engl. to lag = a intarzia) – bacteriile nu intra in diviziune, numarul lor ramanand aproximativ constant; aceasta intarziere se datoreaza refacerii stocului de ribozomi si enzime (daca inoculul provenea dintr-o cultura veche), vindecarii unor leziuni celulare (daca germenii au fost expusi la antibiotice) sau selectarii unor mutante care se adapteaza la noile conditii; in aceasta faza, bacteriile sunt mari, active metabolic si foarte sensibile la agentii antimicrobieni;

q      faza de accelerare – incepe multiplicarea bacteriilor intr-un ritm din ce in ce mai rapid, pana la o valoare constanta a timpului de generatie;

q      faza exponentiala (logaritmica) – inmultirea bacteriilor continua (timpul de generatie fiind constant) pana se consuma unul sau mai multi nutrienti sau se acu-muleaza metaboliti toxici; in aceasta faza, bacteriile au citoplasma intens bazofila, fara incluzii, sensibili-tatea la antibiotice este ridicata iar antigenele sunt bine exprimate; din aceste motive, in cursul acestei faze se recolteaza antigene pentru prepararea vacci-nurilor si se efectueaza antibiograma;

q      faza de incetinire – multiplicarea bacteriana continua insa intr-un ritm mai lent;

q        faza stationara – numarul germenilor vii ramane inca constant deoarece, in cazul epuizarii unui nutrient, toate bacteriile mai sunt vii iar daca s-au acumulat metaboliti, numarul celor care inca se divid este egal cu al celor care mor; bacteriile sunt mature, mai mici, cu citoplasma slab bazofila si cu incluzii; la speciile sporogene, acum incepe formarea sporilor; sensibilitatea la substante antimicrobiene este slaba; aceasta faza este optima pentru identificarea bacteriilor;

q      faza de declin – bacteriile mor progresiv; apar forme de involutie, nepatogene si sporii maturi, la speciile sporogene.

Figura 27 – Dinamica cresterii si multiplicarii bacteriilor