PROCEDURA SPECIFICA

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA GERMENILOR DIN GENUL LISTERIA

CAP. 1. SCOP. DOMENIU DE APLICARE

SCOP

Izolarea si identificarea germenilor din genul Listeria din materiale patologice de origine animala.

DOMENIU DE APLICARE

Procedura se aplica in cadrul Compartimentului de Sanatate Animala pentru diferite categorii de probe de materiale patologice, receptionate si procesate in cadrul sectiei de Bacteriologie a LSVSA Cluj.

CAP. 2. DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

DOCUMENTE DE REFERINTA

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2004, capitol 2.10.14

Metoda COFRAC/CNEVA Pr 116/00/BA 90/00

PG-L-01: Controlul documentelor

PG-L-02: Analiza cererilor de oferta, ofertei si contractelor

PG-L-07: Controlul inregistrarilor

PG-L-10: Controlul echipamentelor de incercare, trasabilitatea masurarii

PG-L-11:Managementul probelor:

PG-L14: Localuri, conditii de mediu si protectia personalului

PG-L-15: Executia analizelor si asigurarea calitatii rezultatelor rezultatelor.

PG-L-16: Controlul datelor

DOCUMENTE CONEXE

IL-LBT-01- Instructiune de lucru Termostat  MIM- 37⁰C, serie LP 1222725181, nr. inv. 2235

IL-LBT-11- Instructiune de lucru Termostat LP  - 30⁰C, serie LP 123836208, nr. inv. 3111

IL-LBT-02 - Instructiune de lucru Autoclav RAYPA AES - 75, seria : 17084,nr. Inv. 2260

IL-LSR-14 - Instructiune de lucru Balanta cu taler Gibertini,serie 107443

IL-LBT-04 - Instructiune de lucru Etuva Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142

IL-LBT-05 - Instructiune Instructiune de lucru Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr. inv. 3017

IL-LBT-06- Instructiune de lucru Hota cu flux laminar Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183

IL- LBT-10- Instructiune de lucru pentru sistemul API Listeria

CAP. 3. DEFINITII SI ABREVIERI

DEFINITII

LISTERIA MONOCYTOGENES - Microorganisme care formeaza colonii tipice pe mediile solide si care prezinta caracteristicile morfologice, fiziologice si biochimice descrise, cand testele se efectueaza in conformitate cu prevederile partii I- a SR ISO 11290-1/2000.

ABREVIERI

MC MANUALUL CALITATII;

PG - PROCEDURA GENERALA DE SISTEM;

PO - PROCEDURA OPERATIONALA;

PS - PROCEDURA SPECIFICA DE INCERCARE ;

IL - INSTRUCTIUNI DE LUCRU ;

SC - SISTEMUL CALITATII ;

AC - ASIGURAREA CALITATII;

HG - HOTARARE GUVERNAMENTALA;

AI - AUDITUL INTERN ;

LBT - LABORATOR ANALIZE MICROBIOLOGIE ALIMENTARA;

BA - BULETIN DE ANALIZE ;

RAC RESPONSABIL ASIGURAREA CALITATII;

EIMI - ECHIPAMENTE INCERCARE ;

DC - DOCUMENTELE CALITATII

RTL - RESPONSABILUL TEHNIC DE LABORATOR

CAP. 4. DESCRIEREA ACTIVITATII PROCEDURATE

CONDITII PREALABILE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform MC si PG-L-02

Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform MC si PG-L-11.

Prepararea mediilor de cultura si a reactivilor se face conform pct.5 din SR ISO 7954/2001.

Protectia personalului

Este obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de protectie si a bonetei.

Deoarece suspensiile obtinute din probele ce urmeaza a fi analizate analizate, culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic, cat si culturile microbiene martor folosite sunt potential contaminante, manipularea acestora se va face cu maxima precautie.

Pentru a se evita ingerarea materialului potential patogen, pipetele folosite in procesul analitic se vor asigura cu dop de vata. Dupa utilizare, pipetele se vor depune in recipiente din sticla cu solutie dezinfectanta.

Protectia mijloacelor de incercare si/sau masurare

Toata sticlaria care se foloseste in aceasta determinare se pastreaza numai sterilizata, in dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prafuirea, contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate.

Balantele cu care se efectueaza cantaririle se instaleaza pe suprafete plane, fara trepidatii, in mediu lipsit de praf si schimbari bruste de temperatura.

Termostatele pentru incubarea mediilor insamantate se urmaresc zilnic si se inregistreaza in caiete speciale.

Verificarea starii de functionare si confirmare metrologica a mijloacelor de masurare si/sau incercare

Balantele, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice/ etalonarii, se verifica periodic conform instructiunilor prevazute in Manualul Calitatii, conform PG-L-10.

In cazul termostatelor, in perioada de valabilitate a verificarii metrologice, inregistrarea temperaturii se face de doua ori/zi in fisele de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11.

Se verifica starea tehnica a sticlariei care se va folosi la determinare.

Nu se vor utiliza mijloace de masurare a caror perioada de valabilitate metrologica este depasita, care nu functioneaza la parametrii corespunzatori sau care nu se incadreaza in clasa de precizie impusa de standardul de lucru.

Lampa bacteriologica-UV se verifica pentru eficienta sterilizarii prin teste de sanitatie de pe suprafetele asupra carora a actionat.

RESURSE NECESARE

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

Termostat LP - 30⁰C, serie 123836208- IL-LBT-11

Termostat la 37^oC tip MIM, seria: serie LP 123836208, nr. inv. 3111- IL-LBT-01

Autoclav RAYPA AES - 75, seria 17084 nr. inv. 2260 -IL-LBT

Balanta cu taler Gibertini,serie 107443 - IL-LBT

Etuva Veb Mlw Medizinische HS 200, serie 15-191, nr. inv. 3142- IL-LBT

Microscop  tip Olympus model CHS, serie 4A0274, nr. inv. 3017   - IL-LBT-05

Hota cu flux laminar tip Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183 - IL-LBT

MATERIALE SI STICLARIE DE LABORATOR

baloane Erlenmeyer de diferite volume, sterile (200 cm³ , 300 cm³);

eprubete sterile cu diametre diferite (16/160 mm, 18/180mm, 10/100mm);

pipete gradate sterile, cu capacitatati diferite (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml), cu gradatii de 0,1 ml;

placi Petri sterile, cu diametrul de 90 mm;

perle din sticla sterile;

anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom si/sau ace de insamantare si baghete sterile;

stative pentru eprubete;

mojare si pistile sterile;

pense/spatule;

cilindrii gradati sterili, cu capacitati diferite (25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml),

MEDII DE CULTURA SI REACTIVI

bulion Semi Fraser - cu concentratie redusa de agenti selectivi - preparat conform Anexei B1 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

bulion Fraser - cu concentratie normala de agenti selectivi - preparat conform Anexei B2 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar Oxford - preparat conform Anexei B3 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar Palcam - preparat conform Anexei B4 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar de sange de oaie - preparat conform Anexei B7 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Agar cu triptona, soia si extract de drojdii (TSYEA)- preparat conform Anexei B5 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion triptona, soia si extract de drojdii (TSYEB) - preparat conform Anexei B6 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate;

Bulion de hidrati de carbon preparat preparat conform Anexei B8 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate

Mediu pentru testul CAMP - Agar cu sange de oaie - preparat conform Anexei B7 din SR ISO 11 290 1/2000 si Caiet medii de cultura-compozitie, mod de preparare, verificarea calitatii, conditii de pastrare, termen de valabilitate

Tulpini pentru testul CAMP:

tulpina St.aureus;

tulpina R.equiI;

tulpina Listeria monocytogenes.

Tulpinile de Staphilococcus aureus, Rhdococcus equi, Listeria monocytogenes,Listeria innocua si ivanovii se pastreaza prin insamantarea lor pe TSYEA inclinat, incubarea la 35 C sau la 37 C 24h -48h sau pana are loc dezvoltarea si se pastreaza la frigider la 3 C C. Se paseaza cel putin odata pe luna.

Solutie de peroxid de hidrogen - preparat la cerere in laboratorul de chimie alimentara;

Suplimente pentru mediile de imbogatire si selective:

supliment demi Fraser

supliment Fraser

supliment Palcam

supliment Oxford

sistem API Listeria

EXECUTIA ANALIZEI, ACTIVITATII

Pregatirea probelor se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare.

Probele supuse analizei sunt reprezentate de :

lichid cefalo-rahidian ; tesut nervos - punte si maduva rahidiana -pentru forma encefalitica ;

ficat, rinichi si/sau splina - pentru forma septicemica ;

lichid stomacal provenit de la avoroni, meconiu, placenta, lichide uterine- pentru forma abortigena ;

Pregatirea dilutiilor de lucru si a subculturilor din toate etapele descrise in modul de lucru al prezentei proceduri specifice se realizeaza de catre executantul de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare.

Pentru determinare se folosesc mijloace de masurare si/sau incercare prevazute la

Proba de analizat si suspensia initiala

Pentru prepararea suspensiei initiale se foloseste ca lichid de dilutie mediul selectiv de imbogatire primara Bulion semi Fraser.

In general pentru a prepara suspensia initiala se adauga o portiune din proba de examinat de x g sau x ml la x ml mediu selectiv de imbogatire primara-Bulion semi Fraser, pentru a obtine un raport intre produsul de examinat si mediu de 1/10(masa/volum sau volum/volum).

IMBOGATIREA primara

Se incubeaza suspensia initiala la 30 C , timp de 24 h 2 h.

IMBOGATIREA SECUNDARA

Dupa incubarea suspensiei initiale (imbogatire primara) timp de 24 h 2 h se transfera 0,1 ml din cultura obtinuta intr-o eprubeta cu 10 ml mediu de imbogatire secundara (bulion Fraser).

Se incubeaza mediul insamantat, timp de 48 h la 37 C .

STRIERE SI IDENTIFICARE

Din cultura obtinuta prin imbogatire primara si incubata timp de 24 h 2 h la 30 C , se ia cultura cu o ansa bacteriologica si se insamanteaza prin striere suprafata primului mediu selectiv de izolare (agar Oxford) in asa fel incat sa se obtina colonii izolate.

Se procedeaza la fel cu al doilea mediu selectiv de izolare (agar Palcam).

Din mediu de imbogatire secundara incubat 48 h la 2h la 37 C se repeta procedeul descris mai sus cu cele doua medii selective de izolare.

Placile Petri cu mediile solide insamantate se intorc cu capacul in jos si se introduc in termostat la 37 C.

Dupa incubare timp de 24 h si o prelungire de inca 18- 24 h (daca dezvoltarea este slaba sau daca nu se observa nici o colonie dupa 24 de ore de incubare), se examineaza placile Petri insamantate pentru prezenta coloniilor presupuse a fi Listeria spp.)

Pe agarul OXFORD coloniile tipice de Listeria spp. dezvoltate dupa o incubare de 24 h sunt mici (1 mm), gri, inconjurate cu un halou negru. Dupa 48 h coloniile devin mai inchise la culoare, cu o posibila tenta verzuie, cu diametrul de 2 mm, cu halou negru si centrul concav.

Pe agarul Palcam dupa 24 de ore Listeria spp. formeaza colonii de culoare verde oliv sau gri verzui, mici, cu diametrul de 1,5 - 2mm, uneori cu centrul negru, dar totdeauna cu halou negru. Dupa 48 h, coloniile de Listeria spp. cu diametrul de 1,5- 2 mm sunt de culoare verzuie, concave in centru si inconjurate de un halou negru.

CONFIRMARE pentru genul Listeria

Alegerea coloniilor pentru confirmare

Pentru confirmare, se aleg din fiecare cutie si din fiecare mediu selectiv (agar Oxford si agar Palcam, cate cinci colonii presupuse a fi Listeria spp..

Daca intr-o cutie sunt mai putin de cinci colonii suspecte, se iau toate pentru confirmare.

Se striaza fiecare colonie selectata pe suprafata agarului cu extract de drojdii, soia, triptona (TSYEA) in asa fel incat sa se dezvolte colonii izolate.

Se introduc cutiile la termostat la 37 C, timp de 18-24 h sau pana cand cresterea este satisfacatoare.

Coloniile tipice au diametrul de 1- 2mm, sunt convexe, incolore si opace, cu marginile regulate. Daca nu exista colonii izolate, se ia o colonie tipica pentru Listeria spp. si se trece pe o alta placa TSYEA.

La culturile obtinute din fiecare colonie pe TSYEA se executa testele care urmeaza :

Reactia catalazei

Se ia o colonie obtinuta si se suspenda intr-o picatura de solutie de peroxid de hidrogen depusa pe o lama microscopica. Aparitia bulelor de gaze indica o reactie pozitiva.

Colorarea Gram

Se coloreaza prin metoda Gram un frotiu preparat dintr-o colonie izolata. Listeria spp. apar ca bastonase subtiri , scurte, Gram pozitive.

Testul mobilitatii (daca este necesar)

Se ia o colonie izolata si se disperseaza intr-o eprubeta care contine TSYEB.

Se incubeaza in termostat la 25 grade Celsius, timp de 8- 24 h pana cand mediul se tulbura usor.

Se pune cu ansa o picatura de cultura pe o lama microscopica. Se acopera picatura de cultura cu o lamela si se examineaza la microscop. Listeria spp. apar ca bastonase subtiri, scurte si prezinta miscari de rostogolire caracteristice.

Culturile dezvoltate la temperaturi mai mari de 25 ⁰C pot fi lipsite de mobilitate. Totdeauna acestea se compara cu o cultura cunoscuta. Cocii, bacilii mari sau bacilii cu miscari rapide de inot nu sunt Listeria spp.

CONFIRMARE pentru Listeria monocytogenes

Testul hemolizei

Daca caracteristicile morfologice, fiziologice si reactia catalazei sunt specifice pentru Listeria spp., se insamanteaza cultura pe suprafata agarului cu sange de oaie pentru a determina capacitatea ei hemolitica.

Se usuca bine suprafata agarului cu sange inainte de folosire. Se ia o colonie izolata si se striaza pe suprafata agarului cu sange. In acelasi timp se striaza cultura unui martor pozitiv (Listeria monocytogenes) si a unui martor negativ (Listeria innocua).

Dupa incubare la 35 ⁰C sau 37 ⁰C timp de 24 h ± 2h, se examineaza culturile de testat si martorii. Listeria monocytogenes prezinta zone clare, inguste de hemoliza b; Listeria innocua nu prezinta zone clare in jurul liniei de striere. Listeria seeligeri prezinta o zona mica de hemoliza; Listeria ivanovii prezinta, in mod obisnuit, zone mari, delimitate clar, de beta-hemoliza. Cutiile se examineaza la o lumina puternica pentru a compara culturile de testat cu martorii.

Utilizarea hidratilor de carbon

Se insamanteaza cu ansa bacteriologica fiecare din bulioanele cu substante hidrocarbonate cu o cultura de TSYEB. Se incubeaza la 37 ⁰C, pana la 5  zile. Reactiile pozitive (formare de acid) se manifesta prin aparitia culorii galbene si au loc, de regula, in 24 - 48 h.

Testul CAMP

Se striaza fiecare din culturile de Staphylococcus aureus si Rhodococcus equi pe suprafata agarului cu sange de oaie in cate o linie fata in fata, astfel incat cele doua culturi sa fie paralele si diametral opuse. Este necesar un inocul uniform, subtire. Acesta se obtine folosind o ansa bacteriologica tinuta in unghi drept fata de agar.

In mod asemanator se striaza separat tulpina de testat, in unghi drept pe aceste culturi, astfel incat sa nu se atinga cultura de testat si culturile de Staphylococcus aureus si Rhodococcus equi, dar punctele lor cele mai apropiate sa fie la distanta de 1 mm- 2 mm. Pe aceiasi placa pot fi striate mai multe tulpini de testat.

Simultan, se striaza culturile martor de Listeria monocytogenes, Listeria innocua si Listeria ivanovii. Daca se foloseste agarul cu sange, cutiile se incubeaza la 37 ⁰C timp de 18 h- 24 h. Daca se folosesc cutii cu strat dublu, se incubeaza la 37 ⁰C timp de 12 h -18 h.

Reactia pozitiva cu Rhodococcus equi apare ca un cap de sageata lat (5 mm . 10 mm) de hemoliza. Reactia este considerata ca negativa daca o zona mica de hemoliza slaba  data de cultura de Staphylococcus aureus si Listeria monocytogenes.

Studierea caracterelor biochimice cu ajutorul sistemului API Listeria

Rezultatele preliminare pot fi confirmate prin teste biochimice suplimentare utilizand sistemul API Listeria. - IL-LBT-10

Interpretarea caracterelor morfologice, fiziologice si a reactiilor biochimice

Toate speciile de Listeria au forma de bastonase mici, Gram pozitive, sunt mobile si catalaza pozitive. Listeria monocytogenes se deosebeste de celelalte specii pe baza caracterelor mentionate in tabelul 1.

Confirmare definitiva

Tulpinile considerate a fi Listeria monocytogenes pot fi trimise la un laborator de referinta pentru Listeria pentru tipizare serologica sau, daca este posibil, si lisogenica. Trimiterea trebuie insotita de toate informatiile necesare, referitoare la tulpina.

Culturi martor

In scopul verificarii capacitatii mediilor de imbogatire, izolare si identificare de a asigura dezvoltarea selectiva a Listeria monocytogenes, o dilutie de cultura de referinta dintr-o tulpina recent izolata de Listeria monocytogenes si o tulpina dintr-o specie bacteriana martor negativ (ex: bacilii, Streptococcus) se introduc introduc intr-un recipient cu mediu de imbogatire primara selectiv. Martorii se lucreaza la fel ca probele de testat pentru a se demonstra ca procedeul de lucru este capabil sa detecteze martorul pozitiv.

CAP. 5. ACTIVITATI FINALE

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Conform interpretarii rezultatelor, se raporteaza prezenta sau absenta Listeriei monocytogenes in proba testata.

CAP. 6. RESPONSABILITATI

Limite de autoritate

Pentru executarea in bune conditii a prezentei proceduri limitele de autoritate sunt:

Responsbalitati

Director Executiv

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura.

Sef de Laborator

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza.

Sef Birou Sanatate Animala

aproba cererea de analiza si primirea probei pentru incercare,

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza,

verifica prin sondaj, rezultatele incercarilor

Responsabilul de incercare

supervizeaza executia incercarii;

raspunde de corectitudinea executiei;

elaboreaza opinii si interpretari asupra rezultatelor inscrise in buletinul de analiza, prin compararea cu reglementari si normative in vigoare,

redacteaza buletinele de analiza, cu observatiile si concluziile aferente;

valideaza executia incercarii;

confirma rezultatul prin semnatura.

verifica nutritivitatea si selectivitatea mediilor de cultura;

gestioneaza tulpinile de referinta

Executantii de analiza

inregistreaza proba in registrul de analiza;

completeaza fisele analitice ale probelor si toate inregistrarile calitatii referitoare la incercarea din prezenta procedura specifica

inregistreaza in fisele de temperaturi ale aparatelor valorile citite

executa sub supravegherea specialistilor operatiile de pregatire a probelor;

executa incercarea conform regulilor din procedura specifica;

verifica functionarea mijloacelor de masurare si/sau incercare;

pregatesc si aseptizeaza spatiile si suprafetele de lucru;

conditioneaza si verifica starea sticlariei utilizata in incercare;

tehnoredacteaza buletinul de analiza

comunica responsabilului de incercare orice problema aparuta in timpul operatiilor efectuate;

CAP. 7. INREGISTRARI

Registru unic primire probe diagnostic  cod R-L-11-1

Registru de diagnostic Necropsic si Bacteriologic cod R-L-11-55

buletine de analiza FG-L-13-01 

fisa de diagnostic bacteriologic  FL-LBT-01

fisa de monitorizare a temperaturii FG-L-14-11

fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

fisa de evidenta a materialelor sterilizate la etuva FL-LBT-56

fisa de solicitare medii de cultura Fl-LBT-57

fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

fisa pentru evidenta autoclavarii infectelor FL-LBT-60

fisa interna de gestionare a deseurilor din laboratoare FO-L-08-09

CAP.8. ANEXE

Fisa pentru evidenta tulpinilor de referinta FL-LBT-54

Fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

Fisa de evidenta a materialelor sterilzate la etuva FL-LBT-56

Fisa de solicitare medii de cultura: FL-LBT-57

Fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

Fisa pentru evidenta control sterilitate si valoare nutritiva a mediilor de cultura FL-LBT-59

ANEXA 1

ANEXA 2

ANEXA 3

ANEXA 4

MEDII DE CULTURA

ANEXA 5

Nr. crt	Data prepararii	CANTITATEA	pH-ul	Valabilitatea	Laboratorul unde se prepara	Semnatura
Directia Sanitara Veterinara si pentru Siguranta Alimentelor Cluj Laborator Sanitar Veterinar de Stat CLUJ   Pag:  din

ANEXA 6

ANEXA 7