Creeaza.com - informatii profesionale despre


Simplitatea lucrurilor complicate - Referate profesionale unice
Acasa » afaceri » agricultura
MENTINEREA CULTURILOR

MENTINEREA CULTURILOR




Mentinerea culturilor

Odata initiata o cultura celulara animala, chiar daca este primara sau linie celulara, poate sa fie mentinuta in vitro o anumita perioada de timp. Aceasta mentinere presupune doua aspecte mai importante: schimbarea mediului urmata de cele mai multe ori de subcultura (pasaj).

Schimbarea mediului

Schimbarea mediului se realizeaza indiferent de capacitatea proliferativa a celulelor din cultura deoarece: celulele pot metaboliza substratul; mediul isi poate pierde unii constituenti; mediul se poate degrada spontan. Intervalele de schimbare a mediului depind de tipul si provenienta celulelor, precum si de intensitatea metabolismului lor.



De exemplu:

HeLa - sunt linii celulare cu crestere rapida; la aceste culturi schimbarea mediului se face la cateva zile, iar pasajul se face saptamanal.

Fibroblastele - sunt linii celulare cu crestere lenta; mediul se schimba saptamanal, iar pasajul se face la 2, 3, chiar 4 saptamani.

Factori care indica necesitatea schimbarii mediului

Scaderea nivelului pH-ului

Semnale pe care putem si trebuie sa le luam in considerare sunt legate de modificarea culorii mediului si de estimarea ratei scaderii. Astfel de la culoarea roz initiala a mediului (culoare data de fenolul rosu) aceasta se transforma in portocaliu, iar apoi in galben. Aceasta schimbare constituie indicatorul cel mai bun al scaderii pH-ului mediului. Trebuie luata in considerare atat rata scaderii pH-ului, cat si nivelul absolut. Rata scaderii pH-ului se poate estima in functie de tipul celulelor cultivate. Astfel, o rata a scaderii de 0,1/zi nu este periculoasa, in sensul in care cultura supravietuieste weekend-ului. O rata a scaderii de 0,4 unitati pH/zi necesita schimbarea mediului in maxim 24-48 de ore. Majoritatea celulelor isi inceteaza cresterea celulara la un pH de 7,0 - 6,5 in timp ce pierderea viabilitatii are loc la un pH situat intre valorile de 6,5 - 6,0.

Concentratia celulara

Cu cat concentratia e mai mare cu atat viteza de consum a mediului e mai mare. Pentru aceasta trebuie sa se tina cont de concentratia celulelor la initierea culturii, rata de multiplicare a celulelor (teoretica) si aspectul morfologic al culturii observate la microscop.

Tipul celulelor cultivate

a)     In cazul celulelor fibroblaste normale (diploide)

Diviziunea lor se opreste odata cu atingerea unei anumite densitati datorita unor factori de depletie a cresterii. Blocajul diviziunii are loc in faza G1 a ciclului celular, iar deteriorarea culturii nu incepe decat dupa 2-3 saptamani.

b)     In cazul celulelor transformate

Este cazul tipic al liniilor celulare continue si a unor celule embrionare, culturile se deterioreaza rapid la densitati celulare ridicate. Din aceasta cauza, schimbarea mediului sau pasajul trebuie sa se faca cu o frecventa mai mare (zilnic).

Morfologia celulara

Semnele morfologice ale deteriorarii celulare sunt:

a)     granularitate in jurul nucleului

b)     vacuolizarea citoplasmei

c)     detasarea celulei de substrat

Aceste semne indica faptul ca mediul trebuie schimbat, sau poate indica probleme mult mai serioase, ca de exemplu utilizarea unui mediu sau ser inadecvat, a unui mediu toxic, contaminarea microbiologica, sau senescenta celulara.

Raportul volum/suprafata in recipientul de cultura

Raport obisnuit este de 0,2-0,5 ml/cm2. Raport optim depinde de:

viteza de difuzie a gazelor in mediul "x" (intr-un anumit mediu)

de necesarul de O2 al unui anumit tip de celule

Pentru celule cu consum mare de O2, cultura se face in placi Petrii in care inaltimea mediului este minima (2mm). Pentru celule cu consum mic de O2, se cultiva la o adancime a mediului de 5mm. La valori mai mari de 5mm difuzia gazoasa scade si cultura sufera.

Subcultura (pasajul)



Intr-o cultura/subcultura nou initiata, celulele traverseaza unele procese caracterizate prin modificarile metabolice tipice adaptarii la noile conditii de mediu, apoi tipice proceselor proliferative. Astfel, dupa o perioada de pauza (faza "lag"), in culturile primare cresterea devine exponentiala (faza exponentiala - "log"). Dupa atingerea densitatii critice celulele se pot mentine o perioada la un nivel constant cantitativ (platou), dupa care cultura intra in declin. In practica, pasajul celular este o etapa care precede momentul atingerii fazei de platou.

Fig. 3. Modelul cresterii celulare in cultura

(dupa J. Freshney, 1987)

Durata fazei "lag" a unei culturi este variabila. Factorii care o influenteaza sunt dependenti de provenienta celulelor. Astfel, daca discutam de o cultura primara, durata fazei depinde de statusul celulelor recoltate. In cazul unei subculturi celulele vor avea o faza "lag" scurta daca celulele sunt preluate in faza de multiplicare exponentiala, sau lunga daca provin din faza stationara ori post stocare. De asemenea, durata fazei depinde de densitatea celulara in cultura (trebuie sa fie de minim 104-105 celule/ml) si de prezenta si concentratia factorilor de crestere prezenti in mediu sau a factorilor autocrini si paracrini secretati de catre celule.

Evaluarea multiplicarii celulare se realizeaza prin determinarea unor parametrii, din care mai importanti ar fi: rata absoluta a multiplicarii exponentiale (N); rata de multiplicare specifica (); rata specifica de consum/productie (K); eficienta multiplicarii celulare; frecventa pasajelor; frecventa generatiilor; intervalul de dedublare a densitatii celulare in timpul multiplicarii exponentiale (dt).

Un alt proces tipic de data aceasta celulelor cultivate este caracterizat de modificarile morfologice suferite si de inter-relatiile celulei cu mediul inconjurator. Este vorba de procesul de atasare si imprastiere (aplatizarea) a celulelor pe substrat, si este intalnit la majoritatea celulelor animale (fig. 2).

fixare dupa 30 min. fixare dupa 60 min.

 

fixare dupa 2 ore fixare dupa 24 ore

 


Fig.4. Morfologia fibroblastelor de soarece in timpul

atasarii si imprastierii la substrat (dupa G. Karp, 1984)

Atasarea celulelor intre ele sau la substrat este un proces dependent de tipul celulei, de substrat si de mediul de cultura in care se afla celulele. Acest proces este mediat de:

a)     glicoproteinele, glicozaminoglicanii si colagenul secretat de catre celule

Cele mai importante glicoproteine sunt fibronectina (similara cu factorul seric de aderare a celulelor la un substrat artificial, numit si CIG - cold-insoluble globulin), laminina si condrionectina. Glicozaminoglicanii (GAG) sau mucopolizaharidele sunt polimeri zaharici cu greutate moleculara mare, care in multe cazuri intra in combinatie cu proteinele formand proteoglicanii. Cei mai importanti GAG sunt: acidul hialuronic, heparin sulfatul, condrioitin sulfatul A si C, keratosulfatul, etc. Acestia interactioneaza in mod specific cu fibronectina si colagenul. Unul dintre cei mai importanti mediatori ai atasarii celulare este colagenul, molecula cu capacitate de legare a membranelor celulare.

b)     ioni de Ca2+ si Mg2+

Rolul jucat de catre acesti ioni este de mediere a atasarii celulare la suprafata altor celule sau la suprafata vasului de cultura.

c)     proteinele derivate din ser

Se asociaza cu cele celulare si intaresc atasarea la substrat sau atasarea intercelulara. Serul contine astfel de factori, unul izolat cu multi ani in urma si care poarta denumirea de "cold-insoluble globulin" (CIG) continand colagen.

Pentru culturile aderente se procedeaza la: extragerea mediului vechi, urmata de disocirea celulara. Majoritatea tipurilor celulare pot fi (si sunt) disociate prin tripsinizare. Unele culturi pot fi disociate strict prin agitarea monostratului (de ex. celulele HeLa). Alte subculturi disociaza greu necesitand actiuni suplimentare a altor enzime, in general de tipul proteazelor: pronaza, colagenoza. Un alt tip de metoda se bazeaza pe un tratament la rece a celulelor intr-un mediu cu EDTA si fara Ca2+ si Mg2+. Disocierea se poate realiza si pe cale mecanica, prin raclarea celulelor de pe suprafata placii de cultura la care a aderat.







Politica de confidentialitate







creeaza logo.com Copyright © 2024 - Toate drepturile rezervate.
Toate documentele au caracter informativ cu scop educational.


Comentarii literare

ALEXANDRU LAPUSNEANUL COMENTARIUL NUVELEI
Amintiri din copilarie de Ion Creanga comentariu
Baltagul - Mihail Sadoveanu - comentariu
BASMUL POPULAR PRASLEA CEL VOINIC SI MERELE DE AUR - comentariu

Personaje din literatura

Baltagul caracterizarea personajelor
Caracterizare Alexandru Lapusneanul
Caracterizarea personajelor negative din basmul
Dialogul- mijloc de caracterizare a personajelor - d-l goe, de i. l. caragiale

Tehnica si mecanica

Centru de inertie(mecanica) Centre de masa
Reprezentarea si cotarea filetelor
Organe de masini - cuplaje mecanice, cuplaje permanente mobile elastice

Economie

Operatiunea de creditare a agentilor economici
Analiza din punct de vedere politic a companiei continental airlines
Operatiunile efectuate de institutiile de credit pe piata monetara - politica monetara obiective, strategii, instrumente, operatiuni

Geografie

Turismul pe terra
Vulcanii Și mediul
Padurile pe terra si industrializarea lemnului



Chestionar pentru fermieri despre piata pamantului si a arendei
Particularitatile biologice si formarea recoltei la sfecla de zahar
Instalatii si utilaje pentru industrializarea laptelui si a produselor lactate
Putregaiul uscat al tuberculilor - Fusarium spp
NOTIUNI DE AGROECOLOGIE
Particularitatile biologice si formarea recoltei la cartof
LUCRARE DE LICENTA MANAGEMENT, INGINERIE ECONOMICA IN AGRICULTURA SI DEZVOLTARE RURALA - CALITATEA SI OBTINEREA VINURILOR LA SC VIZIANU S.R.L
Vestejirea bacteriana a cartofului - Pseudomonas solanacearum



Termeni si conditii
Contact
Creeaza si tu