MENTINEREA CULTURILOR

Mentinerea culturilor

Odata initiata o cultura celulara animala, chiar daca este primara sau linie celulara, poate sa fie mentinuta in vitro o anumita perioada de timp. Aceasta mentinere presupune doua aspecte mai importante: schimbarea mediului urmata de cele mai multe ori de subcultura (pasaj).

Schimbarea mediului

Schimbarea mediului se realizeaza indiferent de capacitatea proliferativa a celulelor din cultura deoarece: celulele pot metaboliza substratul; mediul isi poate pierde unii constituenti; mediul se poate degrada spontan. Intervalele de schimbare a mediului depind de tipul si provenienta celulelor, precum si de intensitatea metabolismului lor.

De exemplu:

HeLa - sunt linii celulare cu crestere rapida; la aceste culturi schimbarea mediului se face la cateva zile, iar pasajul se face saptamanal.

Fibroblastele - sunt linii celulare cu crestere lenta; mediul se schimba saptamanal, iar pasajul se face la 2, 3, chiar 4 saptamani.

Factori care indica necesitatea schimbarii mediului

Scaderea nivelului pH-ului

Semnale pe care putem si trebuie sa le luam in considerare sunt legate de modificarea culorii mediului si de estimarea ratei scaderii. Astfel de la culoarea roz initiala a mediului (culoare data de fenolul rosu) aceasta se transforma in portocaliu, iar apoi in galben. Aceasta schimbare constituie indicatorul cel mai bun al scaderii pH-ului mediului. Trebuie luata in considerare atat rata scaderii pH-ului, cat si nivelul absolut. Rata scaderii pH-ului se poate estima in functie de tipul celulelor cultivate. Astfel, o rata a scaderii de 0,1/zi nu este periculoasa, in sensul in care cultura supravietuieste weekend-ului. O rata a scaderii de 0,4 unitati pH/zi necesita schimbarea mediului in maxim 24-48 de ore. Majoritatea celulelor isi inceteaza cresterea celulara la un pH de 7,0 - 6,5 in timp ce pierderea viabilitatii are loc la un pH situat intre valorile de 6,5 - 6,0.

Concentratia celulara

Cu cat concentratia e mai mare cu atat viteza de consum a mediului e mai mare. Pentru aceasta trebuie sa se tina cont de concentratia celulelor la initierea culturii, rata de multiplicare a celulelor (teoretica) si aspectul morfologic al culturii observate la microscop.

Tipul celulelor cultivate

a)     In cazul celulelor fibroblaste normale (diploide)

Diviziunea lor se opreste odata cu atingerea unei anumite densitati datorita unor factori de depletie a cresterii. Blocajul diviziunii are loc in faza G1 a ciclului celular, iar deteriorarea culturii nu incepe decat dupa 2-3 saptamani.

b)     In cazul celulelor transformate

Este cazul tipic al liniilor celulare continue si a unor celule embrionare, culturile se deterioreaza rapid la densitati celulare ridicate. Din aceasta cauza, schimbarea mediului sau pasajul trebuie sa se faca cu o frecventa mai mare (zilnic).

Morfologia celulara

Semnele morfologice ale deteriorarii celulare sunt:

a)     granularitate in jurul nucleului

b)     vacuolizarea citoplasmei

c)     detasarea celulei de substrat

Aceste semne indica faptul ca mediul trebuie schimbat, sau poate indica probleme mult mai serioase, ca de exemplu utilizarea unui mediu sau ser inadecvat, a unui mediu toxic, contaminarea microbiologica, sau senescenta celulara.

Raportul volum/suprafata in recipientul de cultura

Raport obisnuit este de 0,2-0,5 ml/cm². Raport optim depinde de:

viteza de difuzie a gazelor in mediul "x" (intr-un anumit mediu)

de necesarul de O₂ al unui anumit tip de celule

Pentru celule cu consum mare de O₂, cultura se face in placi Petrii in care inaltimea mediului este minima (2mm). Pentru celule cu consum mic de O₂, se cultiva la o adancime a mediului de 5mm. La valori mai mari de 5mm difuzia gazoasa scade si cultura sufera.

Subcultura (pasajul)

Intr-o cultura/subcultura nou initiata, celulele traverseaza unele procese caracterizate prin modificarile metabolice tipice adaptarii la noile conditii de mediu, apoi tipice proceselor proliferative. Astfel, dupa o perioada de pauza (faza "lag"), in culturile primare cresterea devine exponentiala (faza exponentiala - "log"). Dupa atingerea densitatii critice celulele se pot mentine o perioada la un nivel constant cantitativ (platou), dupa care cultura intra in declin. In practica, pasajul celular este o etapa care precede momentul atingerii fazei de platou.

Fig. 3. Modelul cresterii celulare in cultura

(dupa J. Freshney, 1987)

Durata fazei "lag" a unei culturi este variabila. Factorii care o influenteaza sunt dependenti de provenienta celulelor. Astfel, daca discutam de o cultura primara, durata fazei depinde de statusul celulelor recoltate. In cazul unei subculturi celulele vor avea o faza "lag" scurta daca celulele sunt preluate in faza de multiplicare exponentiala, sau lunga daca provin din faza stationara ori post stocare. De asemenea, durata fazei depinde de densitatea celulara in cultura (trebuie sa fie de minim 10⁴-10⁵ celule/ml) si de prezenta si concentratia factorilor de crestere prezenti in mediu sau a factorilor autocrini si paracrini secretati de catre celule.

Evaluarea multiplicarii celulare se realizeaza prin determinarea unor parametrii, din care mai importanti ar fi: rata absoluta a multiplicarii exponentiale (N); rata de multiplicare specifica (µ); rata specifica de consum/productie (K); eficienta multiplicarii celulare; frecventa pasajelor; frecventa generatiilor; intervalul de dedublare a densitatii celulare in timpul multiplicarii exponentiale (dt).

Un alt proces tipic de data aceasta celulelor cultivate este caracterizat de modificarile morfologice suferite si de inter-relatiile celulei cu mediul inconjurator. Este vorba de procesul de atasare si imprastiere (aplatizarea) a celulelor pe substrat, si este intalnit la majoritatea celulelor animale (fig. 2).

fixare dupa 30 min. fixare dupa 60 min.

fixare dupa 2 ore fixare dupa 24 ore